Долгое время химическая структура антигенов Rh оставалась загадкой. Многочисленные попытки выделить этот антиген в чистом виде и проверить его серологические свойства резус-антителами были безуспешными. Высказывалось суждение о том, что этот антиген в серологически активном виде не может суще­ствовать вне клеточной мембраны и, будучи выделенным из нее, тотчас инакти-вируется. Такое мнение поддерживалось сведениями о том, что нагревание и вы­сушивание эритроцитов снижают серологическую активность антигенов Rh.

Разработка адекватных методов исследования гидрофобных структур мем­браны эритроцитов дала существенный сдвиг в этой области. Появились сообщения Green [316] о том, что экспрессия антигенов D и С на эритроцитах связана с тиоловыми группами, и, следовательно, эти антигены по своей при­роде относятся к белкам, а не к полисахаридам, как считали раньше по анало­гии с полисахаридами А и В.

Использование глутатионмалеимидмембранных зондов также указывало на причастность экзофациальных тиоловых групп к D-специфичности. Однако значение свободных тиоловых групп в формировании антигенов Rh было по­ставлено под сомнение Suyama и соавт. [646].

Далее было показано (Green [315]), что липидные фракции, экстрагиро­ванные из стромы эритроцитов n-бутанолом, а также получаемый при этом не­растворимый белковый осадок не обладают серологической активностью по отдельности, но при объединении этих фракций специфическая D-активность субстрата вновь проявляется. Таким образом, стала проясняться белково-липидная природа субстанции Rh.

Hughes-Jones и соавт. [366] подтвердили, что основными компонентами, не­обходимыми для экспрессии антигена D, являются фосфолипиды, поскольку обработка мембран эритроцитов фосфолипазами А2 и С инактивировала анти­гены D, Сс и Ее. Интересная деталь: как было установлено Hughes-Jones и со­авт. [366], Green и соавт. [320], анти-Э-антитела, адсорбированные на эритро­цитах D+, предотвращали инактивацию антигена D фосфолипазой А2, что ука­зывало на специфичность воздействия этого фермента именно на структуру-носитель антигена D.

Попытки выделить и идентифицировать белок Rh, предпринятые до 1980-х годов, позволили составить общую физико-химическую характеристику антиге­нов Rh. Предварительно установлено, что белок D имеет мол. массу 7-10 кДа. Другие исследователи сообщили, что антигены Rh расположены на анионном транспортном белке в полосе 3 [678]. Полоса 3, как теперь известно, соответ­ствует антигенам Diego. Впоследствии полученные результаты были объяснены излишним протеолизом полипептидов D при очистке, а также тем фактом, что оба белка одинаково гидрофобны и мигрируют вместе в процессе выделения из мембраны эритроцитов.

Прорыв в исследовании антигенов Rh произошел в начале 1980-х годов, ког­да появились методы выделения растворимых комплексов «D-aura-D» имму-нопреципитацией антигенов специфическими антителами, меченными ради­оактивным йодом (Moore и соавт. [483], Ridgwell и соавт. [564]). Вскоре были идентифицированы полипептиды с мол. массой 32-34 кДа, несущие серологи­ческую активность D, Сс и Ее, и отсутствовашие на эритроцитах Rh_nu!1. Каждый полипептид содержал экзофациальные тиоловые группы [564].

Далее выяснилось, что антигены е и Е расположены на одном полипеп­тиде, а антиген D - на другом.

Картирование Rh-полипептидов, проведенное Bloy и соавт. [172], Blanchard и соавт. [168], показало, что фракции, иммунопреципитированные сыворотками анти-с и анти-Е, практически идентичны, а фракции, иммуно-преципитированные сыворотками анти-D, существенно от них отличаются.

Hughes-Jones и соавт. [363] не наблюдали конкурентного подавления связыва­ния анти-с-антител антителами анти-Е и анти-D, а также ингибиции связывания анти-Е-антител антителами анти-с и анти-D, что свидетельствовало о размещении антигенов D, с и Е на разных участках полипептидов. При картировании установ­лено, что полипептид D имеет отличительные участки, не характерные для поли­пептидов с и Е, и это полностью совпало с результатами иммунопреципитации.

Gahmberg [295] отметил, что полипептид D не содержит углеводов в отли­чие от других белков, расположенных на внеклеточной поверхности мембраны эритроцитов. Такое заключение было основано на невозможности пометить полипептид D галактозоксидазой и перийодатом, неспособностью очищенно­го полипептида связываться в лектиновых колонках, а также неэффективно­стью обработки эндо-1М-ацетилглютаминазой Н и эндо-|3-галактозидазой.

Гликозилирование как обычная составляющая синтеза мембранных элемен­тов не характерно для белка Rh. Он собирается в виде комплекса, включающе­го готовые полипептиды Rh и гликопротеины Rh, причем полипептиды Rh явля­ются продуктом одного гена, расположенного на хромосоме 1, а гликопротеины Rh - продуктом другого гена, расположенного на хромосоме 6. Точно так же со­бираются антигены системы Kell: белок Кх ковалентно связывается с гликозили-рованным гликопротеином Kell, но оба субстрата являются продуктами разных генов, один из которых расположен на аутосоме, другой (Кх - на хромосоме X.)

После того как полипептиды Rh были идентифицированы, несколько групп исследователей попытались изучить их аминокислотную последова­тельность, а также создать олигонуклеотидные зонды и выделить ДНК, ко­дирующую Rh. Наиболее эффективными оказались методы препаративной иммунопреципитации (Avent и соавт. [147], Bloy и соавт. [172] с использо­ванием мышиных и человеческих моноклональных антител. Другие иссле­дователи (Saboori и соавт. [590]) использовали для очистки белков неимму­нологические методы, в частности хроматографию в гидроксиапатите каль­ция (Saboori и соавт. [589]). Очищенные полипептиды метили радиоактив­ным йодом и расщепляли химотрипсином.

Исследования показали, что полипептид Rh, преципитированный анти-D-антителами, имел ту же N-концевую последовательность (до остатка 13), что и полипептид Rh, преципитированный мышиными моноклональными антите­лами серии R6A [147]. Однако, поскольку антитела R6A реагировали с эри­троцитами D—, следовал вывод, что антиген D находится на другом полипеп­тиде, реагирующем с анти-О-антителами, и что анти-О-антитела человека и моноклональные антитела R6A мыши определяют 2 разных, но тесно связан­ных полипептида. Исследование аминокислотной последовательности белков, выделенных хроматографией в гидроксиапатите из клеток D+ и D-, подтвер­дило их сходство

О том, что гены RHнаходятся на хромосоме 1, свидетельствовал ряд фактов.

К началу 1970-х годов накопились данные о частичной сцепленности генов RHс генами наследственного эллиптоцитоза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G-6-PD), пептидазы-С (РерС) и фосфоглюкомутазы (PGMj).

Результаты семейных исследований указывали на то, что перечисленные гены образуют взаимосвязанную группу близкорасположенных локусов и на­следуются вместе независимо от пола. Из накопленных сведений можно было сделать только один вывод: гены RHне расположены на хромосомах X и Y. Вопрос, на какой хромосоме они располагаются, оставался открытым.

Сдвиг в этой области достигнут благодаря гибридизации ядерных клеток мыши и человека (Ruddle и соавт. [587]). При культивировании гибридных клеток, име­ющих 2 набора хромосом (человека и мыши), человеческие хромосомы посте­пенно вытеснялись мышиными. Эта модель оказалась удобной для изучения про­дукции ферментов, в частности пептидазы С. Установлено, что утрата хромосо­мы 1 сопровождалась потерей способности культивируемых клеток продуцировать пептидазу-С, а поскольку гены РерС, G-6-PD, PGM_}и RHсвязаны, было сделано заключение, что вся группа генов, в том числе ген RH, находится на хромосоме 1.

Дополнительные данные в поддержку этого заключения были получены Marsh и соавт. [462]. Авторы наблюдали больного миелофиброзом, у которого была кровяная химера: 7 % эритроцитов, циркулирующих в его кровотоке, были резус-положительными (CcDee), а остальные 93 % - резус-отрицательными (cde). Один из родителей больного имел фенотип CCDee, т. е. не содержал га-плотипа cde, который мог передать по наследству. Сам пациент передал гапло-тип CDeсвоему сыну. Авторы предположили, что эритроциты CcDee пациента происходили из ростка, в котором гаплотипы CDeи cdeбыли функциональны­ми, а эритроциты cde происходили из ростка, в котором гаплотип CDeявлялся молчащим {cde/ ). При хромосомном анализе выявлена делеция короткого плеча хромосомы 1 в 95 % ядерных клеток крови пациента, на основании чего авторы заключили, что потеря небольшого участка короткого плеча хромосо­мы 1, очевидно, привела к потере функционального гаплотипа CDe. Поскольку пациент был гетерозиготен по локусу PGM₁и содержал оба типа этого фермен­та, авторы сделали вывод, что локус RHне только расположен на хромосоме 1, но и отстоит от центромеры хромосомы дальше, чем локус PGM.

Задолго до установления молекулярных различий в структуре полипептидов Rh и кодирующих их генов иммуносеролога классифицировали мутации, даю­щие начало новым групповым признакам, по поведению тех или иных антиге­нов и антител в серологических реакциях.

Доссе [50] разделил мутации на 3 категории.

Мутации с полной автономностью. Примером такой мутации служили ан­тигены С и C^w в системе антигенов CC^wc, гены которых до последних лет счи­тались аллельными (см. C^wи С*). Антиген С^w полностью автономен по отноше­нию к антигену С. Это проявляется в том, что люди СС, Сс и ее могут выраба­тывать антитела aHra-C^w. Некоторые сыворотки анти-С содержат комбиниро­ванные антитела aHra-C+C^w в несепарируемой форме и не могут быть разделе­ны на анти-С и анти-С ^w адсорбцией эритроцитами С и C^w. Вместе с тем чистые анти-С^антитела (без примеси анти-С) встречаются относительно часто.

Вначале предполагали, что антиген C^w наследуется независимо от С и с, проявляя полную автономность. Однако вскоре выяснилось, что он чаще при­сутствует в эритроцитах С+, чем в эритроцитах С-.

Аналогичными автономными свойствами обладает антиген С^х по отношению к антигенам С, с и C^w, а также антиген E^w по отношению к антигенам Е и е.

Мутации без автономности. Этот тип мутации отражается на количе­стве синтезируемого антигенного субстрата, не затрагивая его специфиче­ских свойств. Например, эритроциты D^u агглютинируются не всеми сыворот­ками анти-D, которые в 100 % случаев реагируют с обычными эритроцитами D+. D не имеет собственной антигенной специфичности, отличающейся от D, однако передается по наследству кодоминантно, как D и все другие груп­повые антигены. Антитела анти-D могут быть полностью удалены из сыво­ротки адсорбцией эритроцитами D^u, но сыворотка анти-D не может быть раз­делена на анти-D и анти-D¹¹ дифференциальной адсорбцией. В совокупно­сти все эти признаки свидетельствуют о существовании генной мутации или модификации гена D, которая не является автономной и проявляется лишь в виде слабовыраженного антигенного вещества.

Race и Sanger [544], исследуя специально отобранные сыворотки анти-С и анти-Е, установили, что гены С и Е в позиции цис и транс влияют на экспрессию одноименных антигенов (табл. 4.9). Ген Е в позиции цис угнетает продукцию ан­тигена С, а ген С в позиции транс - продукцию антигена Е. Впоследствии авто­ры несколько изменили свои взгляды, придя к выводу, что эффект супрессии мо­жет быть обусловлен не взаимодействием генов, а наличием в указанных, заранее отобранных сыворотках примеси других антител. Некоторые сыворотки анти-С содержат фракцию анти-Се-антител, поэтому сильнее реагируют с эритроцита­ми лиц Cde/cdEи Cde/CDe, имеющими оба антигена (С и Се). Сыворотки анти-Е иногда содержат анти-СЕ-антитела, за счет чего сильнее реагируют с эритроцита­ми лиц CdE/cdeи CDE/cDe, несущими антигены Е и СЕ.

Однако для того чтобы полностью исключить взаимовлияние генов С и £ в разных генетических комбинациях, нет достаточных оснований. На других мо­делях эффект транс и цис в той или иной мере проявляется.

Таблица 4.9 Выраженность антигенов С и Е у лиц с различным генотипом RH

Ген Dв положении транс оказывает подавляющее действие на синтез анти­генов С, Е и е (Race и Sanger [544]). У лиц CDe/cDEантиген С вырабатывается в меньшем количестве, чем у людей Cde/cde(Lawler и Race [412]).

Антигены f (се), V (ce^s), rh.(Ce), CE (Rh22), cE (Rh27) и Ce^s(Rh42) являются в соответствии с представлениями, существовавшими вплоть до последних лет, результатом г/мс-эффекта генов се, ce^s, Се, СЕ, сЕ и Се⁵. В положении транс гены сне, си e^s, С пене продуцируют антиген f и другие перечисленные выше антигены - ce^s, rh., СЕ, сЕ и Ce^s соответственно.

У супругов CDe/CDeх CDe/CDeвсе дети будут гомозиготы CDe/CDe. В се­мье, где один из родителей CDe/CDe, а другой - cde/cde, все дети будут гетерози-готы CDe/cde. Когда родители гетерозиготы CDe/cdeх CDe/cde, 75 % детей будут резус-положительными, 25 % - резус-отрицательными; из всех детей 25 % будут гомозиготы CDe/CDe, 50 % - гетерозиготы CDe/cdeи 25 % - гомозиготы cde/cde.

Винер не разделял теорию трех генов Фишера - Рейса, оставаясь последо­вательным приверженцем концепции одного гена. Не признал он и кроссин-говер. Действительно, при наличии одного гена кроссинговер маловероятен. Убежденность, с которой Винер отстаивал свои взгляды, побуждает критически отнестись к рассмотрению этого вопроса.

Легко приняв на веру подкупающую простотой теорию Фишера - Рейса, мало кто из специалистов, кроме Винера, подверг ее серьезной перепроверке. Прокоп и Геллер в фундаментальном труде «Группы крови человека» [90] пи­шут, что Винер критиковал теорию кроссинговера, неоднократно проверяя ее по таблицам популяционно-генетических исследований и не находя в них под­тверждения ожидаемого кроссинговера. Напротив, некоторые позиции противо­речили теории Фишера.

По мнению Рейса [544], на кроссинговер указывали лишь единичные наблю­дения, из которых трудно было сделать однозначное заключение о существова­нии этого феномена.

В концепции Типпетт также нет места кроссинговеру. Трудно ожидать пере­креста двух расположенных рядом тесно сцепленных локусов. При таких усло­виях более вероятны делеции, мутации и конверсии.

Как и любое теоретическое построение, рассмотренные выше 3 генетиче­ские теории - это лишь предположения, попытки систематизировать, объяснить экспериментальные данные, исходя из представлений того времени.

Сегодня можно высказать суждение (ни в коей мере не подвергая сомнению теорию Фишера), что порядок расположения генов RHможет соответствовать последовательности D-E-Crэто ничего не меняет на фенотипическом уров­не. Кроссинговер (если он в системе Rh происходит) может дать такие же соче­тания антигенов при последовательности генов D-E-C, как и при последова­тельности D- С-Е (см. рис. 4.2). Последовательность генов С - D- Е также ничего не меняет в Rh-фенотипе человека, если допустить возможность выбо­рочной конверсии генетического материала при мейозе.

Гаплотип cDeвстречается в 10-13 раз чаще у негроидов, чем у европеоидов (42,3 и 3,2 % соответственно [108]). Если бы гаплотип cDeявлялся результатом кроссинговера, как полагал Фишер, то частота гаплотипов Cde, cdE, CDEи CdEтакже должна быть существенно выше у негроидов, чем у европеоидов. Однако в действительности частота указанных гаплотипов у представителей этих двух рас приблизительно одинакова. Тем не менее идея Фишера о том, что редкие га-плотипы образуются посредством кроссинговера частых гаплотипов, признает­ся всеми исследователями как весьма элегантная, и если кроссинговер не был до сих пор убедительно доказан, то он и не был полностью опровергнут.

Теоретические построения Типпетт, при всей их оригинальности, также не могут рассматриваться как истина в последней инстанции. В них много допу­щений. Не ясно: почему чаще образуются антитела анти-С, анти-с, анти-Е и анти-е, чем антитела анти-се, анти-Се, анти-сЕ и анти-СЕ, хотя обе группы ан­тител стимулированы, как полагает Типпетт, одним полипептидом? Почему так часто образуются несепарируемые анти-ЭС-антитела, если антигены D и С находятся на разных полипептидах? Почему чаще вырабатываются анти-DE-антитела, чем анти-Е, но реже, чем анти-DC? Винер объяснял это существова­нием двух агглютиногенов: Rh_o' (DC) и Rh_o" (DE), которые встречаются с раз­ной частотой. По мнению Фишера, это объясняется тем, что гены D и £, а зна­чит и антигены D и Е, дальше отстоят друг от друга, чем D и С, поэтому веро­ятность образования анти-ОС-антител выше, чем анти-DE. С позиций концеп­ции Типпетт образование комбинированных антител анти-DC и анти-DE мож­но объяснить, допустив, что эпитопы Rh мозаично переплетены на поверхности эритроцитов в виде близкорасположенных пар DC и DE.

Концепция двух генов пока еще осмысливается иммуносерологами, привык­шими оперировать категориями Винера, Фишера и Рейса. Если антитела анти-се, анти-Се, анти-сЕ и анти-СЕ определяют продукты гена RHCE, то почему ан­титела анти-DC и анти-DE не могут свидетельствовать о существовании гена RHDCEс аллелями DCи DE, подобно тому, как считал Винер?

Пока ответом на этот вопрос служит открытие двух разных протеинов, несу­щих антигены D и СЕ. Однако не исключено, что в ближайшем будущем могут быть найдены протеины, несущие одновременно специфичность D и С, D и Е. Гибридные гены DC-D/D-DC, продуцирующие необычные иммунодоминант-ные протеины, известны. Вместе с тем следует признать, что теория двух генов представляет несомненный прогресс в иммуносерологии и весьма перспектив­на для дальнейших молекулярно-биологических изысканий.

Как справедливо указывают Issitt, Anstee [374], дискуссия относительно трех генетических теорий системы резус далека от завершения. Однако эта дискуссия не содержит антагонистических противоречий. Как первая, так и вторая, и тре­тья теории не противоречат практике и вполне устраивают иммуносерологов, су­дебных медиков, генетиков и других специалистов. Различаясь по форме, эти кон­цепции никак не сказываются на интерпретации результатов фенотипирования при использовании конкретных тестовых реагентов. В этих теориях практически все позиции общие, за исключением количества детерминирующих генов.

Номенклатура Фишера - Рейса не противоречит номенклатуре Винера, так как опирается на одни и те же факты (обе исследовательские группы, Рейса в Англии и Винера в Америке, обменивались найденными сыворотками и сопо­ставляли полученные результаты). Концепция Типпетт никаких изменений в су­ществующую номенклатуру не внесла.

И все-таки, может быть, более всех прав Винер, и наблюдаемое разнообра­зие фенотипов резус, несмотря на национальные и расовые особенности, обе­спечивается одним геном? Многочисленных воздействий на дистанции «фор­мирование гена —i ген —> готовый продукт» в виде кроссинговера, конверсии, мутации, делеции, пространственного взаимовлияния генов друг на друга и всего, что может воздействовать на кодирующую ДНК и синтез полипептидов более чем достаточно, чтобы обеспечить существующее разнообразие. Вряд ли для этого нужно 3, а тем более 50 генов, достаточно одного. Теория Типпетт по­строена в унисон теории Винера. Она по сути представляет собой возврат от те­ории трех генов или более к теории одного гена.