Категория: Система RH

Опубликовано: 19 апреля 2014

Eggington и соавт. [270] считают, что применение пулов эритроцитов снижает чувствительность метода, затрудняет интерпретацию результатов, уменьшает процент выявления антител. К такому же выводу пришли Bombail-Girard и соавт [177], Phillips                                                                                                                      

Возможность создания принципиально отличающейся системы, не связан­ной с прямым выявлением агглютинации эритроцитов, обсуждается в работе Narayanan и соавт. [503]. Авторы предложили новый способ учета реакции аг­глютинации в обычном и ультрафиолетовом свете. Эта система получила поло­жительную оценку Министерства здравоохранения США (Poole и соавт. [533]).

Метод дает возможность объективно оценить результаты непрямой реакции Кумбса, однако ряд технических особенностей не позволяет использовать его в конвейерной работе.

Предложены 6 приемов оценки иммуносерологических методов (Voak [679], Poole и соавт. [533]).

1. Тест на чувствительность, при котором применяют заведомо слабые анти­тела. Применение сильных антител сглаживает картину, так как они имеют вы­сокую авидность, поэтому их легко обнаруживают даже в больших разведениях.
2. Тест на юспроизводимость метода с использованием гетерозиготных образцов эритроцитов, сенсибилизированных слабыми референтным aHra-D-антителами IgG.
3. Титрование антител, относящихся к разным антигенным системам эритро­цитов: анти-К, анти-Ру^а, анти-Jk³ и др. - для установления уровня чувствитель­ности в отношении антигенов каждой системы.
4. Пробный подбор совместимых пар донор - реципиент с применением све­жих образцов сыворотки и эритроцитов. Такой подбор позволяет выявить лож-ноположительные результаты, обусловленные комплементом исследуемой сы­воротки и антикомплементарными антителами, в основном анти-СЗё, присут­ствующими в тестовых антиглобулиновых реагентах.
5. Сравнительные испытания (не менее 3000 тестов) в разных лечебных учреждениях. Такие испытания хорошо выявляют недостатки и слабости лю­бых тестовых систем, обладающих разной степенью чувствительности к тем или иным антигенам и антителам.
6. Тесты с гомо- и гетерозиготной формой различных антигенов для отобра методики, которая будет хорошо работать с гетерозиготными эритроцитами. Например, микроплатовые системы Solid Screen (Biotest) и Capture (Immuno) не требуют использования эритроцитов, гомозиготных по данным антигенам, и лучше выявляют слабые антитела, чем системы микрокапиллярных гелевых ко­лонок или классическая непрямая проба Кумбса (Poole и соавт. [533]).

Однако дальнейшие исследования показали, что примерно 50 % образцов эритроцитов Kk низкоавидны при выявлении антител Келл-Челлано. Это дает основание беспокоиться о качестве скрининга антител, так как невозможно обеспечить гомозиготными по антигену К эритроцитами все панели для скрининга антител из-за относительной редкости гомозигот КК: 2-3 образца на 1 тыс. (Phillips, Voak [521]).  щ

В литературе имеются сведения о создании иммуносерологических методов нового поколения, основанных на использовании антигенов эритроцитов, выде­ленных в чистом виде. Возможно, самая лучшая система, которая будет разра­ботана в ближайшем обозримом будущем, позволит проводить скрининг анти­тел с помощью биологического микрочипа, на который нанесены все известные трансфузионно опасные антигены. Над созданием подобных методов работает несколько групп ученых: одна - под руководством М. Scott в Международной референс-лаборатории групп крови (Бристоль, Англия), другая - под руковод-ством М. Read в Центре крови Нью-Йорка. Не исключено, что уже в ближай­шие годы мы можем стать свидетелями новых автоматизированных иммуно-ферментных методов определения клинически наиболее значимых эритроци-тарных антител без использования эритроцитов (Ekins [271], Ekins, Chu [272]). Попытки создания биочипов предпринимаются и в нашей стране.

Проанализированные нами данные литературы убеждают в том, что, несмо­тря на большой выбор автоматизированных методик, наилучшей до настоящего времени остается непрямая проба Кумбса.

По нашему мнению, упомянутое выше малогабаритное оборудова­ние Н.И. Васильева, специально предназначенное для проведения этой пробы, позволяет обеспечить высокое качество подбора совместимой крови для пере­ливания реципиенту.

Категория: Система RH

Опубликовано: 19 апреля 2014

История инструментальных автоматизированных методов иммуносерологического исследования начинает свой отсчет с 1960-х годов.

В 1963 г. в США McNeil и соавт. [473] предложили для определения группы крови анализатор «Техникой», применявшийся для биохимических исследова­ний. В основу прибора положен принцип движущихся порций эритроцитов, от­деленных друг от друга воздушной перемычкой, по спирально извитым пласти­ковым трубкам, в которые подают тестовые стандартные сыворотки. Длина тру­бок и скорость проталкивания образцов были рассчитаны таким образом, чтобы тестовые сыворотки успевали прореагировать с антигенами исследуемых эри-троцитов. Результаты учитывали фотометрическим методом: измерением раз­ности светопоглощения реагирующей смеси до и после реакции.

Анализатор McNeil представлял собой одноканальный прибор, что не позво­ляло проводить несколько исследований параллельно.

Для повышения чувствительности анализатора Sturgeon и соавт. [641] предложили предварительную обработку эритроцитов протеолитическими ферментами растительного происхождения. Наиболее эффективным для этих целей оказался бромелин - фермент, выделяемый из млечного сока стеблей ананасов.                                                                                                                                                                                                                                                 

Далее Sturgeon и соавт. [643] применили многоканальные варианты прибо-ра, анализирующие образец крови одновременно по нескольким параметрам, что существенно расширило возможности анализатора и его пропускную спо­собность. Авторы сконструировали 8-канальный прибор, определяющий груп­пу крови АВО и резус.

Затем были сконструированы 10-15-канальные системы (Peoples и соавт. [518], Moore, Fernandes и соавт. [478]), что позволило автоматизировать не только определение антигенов эритроцитов АВО и резус, но и проводить реакции на сифилис (Shoeter и соавт. [610]) и австралийский антиген (Berkman и соавт. [166], Moore, Fernandes [478]).

Широкое применение нашел БМЦ-тест (бромелинметилцеллюлозный), который повысил чувствительность приборов при выявлении антител Rh-Hr, Lewis, Kell, Daffy.

Заметным прогрессом в развитии автоматизированных методов серологи­ческого исследования явилась предложенная Lalezari [407] методика с исполь­зованием полибрена, с помощью которой выявляли антигены и антитела си­стемы Daffy, Kell, Kidd, MNSs в тех случаях, когда ферментная техника оказы­валась неэффективной.

Протеолитические ферменты существенно активируют реакцию связывания ан­тигенов и антител системы резус, однако, по мнению некоторых авторов, разруша­ют антигены Kell, Daffy (Nevaulinna, Pircola [505], A.A. Рагимов, Н.Г. Дашкова [92]).

Habibi и соавт. [332] применили одновременно несколько ферментных те­стов: ПМЦ-тест (папаинметилцеллюлозный), ТМЦ-тест (трипсинметилцел-люлозный) и полибреновый тест, что дало возможность проводить скрининг антител различного характера с максимально широкой специфичностью, улав­ливать те разновидности антител, которые выявляют исключительно каким-либо одним методом.

Более того, была автоматизирована антиглобулиновая проба Кумбса (Valeri и соавт. [675]), что создало предпосылки для внедрения оборудования, предназна­ченного для повседневного автоматизированного скрининга антител различной специфичности (Cotton, Ray [239], Moore [477]), в том числе аутоантител, фик­сированных на эритроцитах (Gorska и соавт. [310]), а также послужило основой автоматизации пробы на индивидуальную совместимость донора и реципиента при переливании эритроцитов (Wattar и соавт. [699]).

Rowe и соавт. [586] предложили полностью автоматизированную многоканальную систему «Техникой М-16» с микропроцессорным оснащением для интерпретации результатов серологических реакций и ввели в систему сканирующее лазерное устройство, идентифицирующее исследуемые образцы крови по бар-коду. Впервые бар-код в анализаторах групп крови был применен во французских приборах «Групаматик».

Одновременно с созданием в США анализаторов групп крови «Техникой» во Франции с 1963 по 1969 год под руководством Matte [465] была разработа­на принципиально отличающаяся автоматизированная система «Групаматик» (Groupamatic-50, -250, -360 соответственно на 50,250,360 определений в 1ч).

В отличие от аппаратов «Техникой» в приборах «Групаматик» был применен ком­пьютер, что обеспечило автоматическую интерпретацию результатов и вывод их на печать. Наиболее производительный вариант прибора представлял собой 12-каналь-ную систему, рассчитанную на исследование 360 образцов крови в 1 ч (Soulier [621]).

Другое немаловажное отличие системы «Групаматик» от системы «Техникой» заключалось в способе учета результатов серологических реакций. Визуальный учет результатов в автомате был заменен оптическим способом ре­гистрации: фотометрией жидкой части смеси и осадка (Unger, Ramgren [672]).

В приборах «Групаматик» для повышения чувствительности реакции было применено центрифугирование реагирующей смеси с последующим ресуспен-дированием посредством встряхивания. Это важная деталь в проведении имму-носерологических реакций.

Весьма существенным также было то, что выдачу ошибочных результатов (не укладывающихся в закономерности групповой дифференцировки крови людей) прибор блокировал.

Последующее техническое усовершенствование автоматов «Групаматик» по­зволило увеличить объем исследований, выполняемых при апробации донор­ской крови, а именно: ввести исследование сыворотки крови доноров на си­филис, гепатит, а также идентифицировать дозы крови при их выдаче потреби­телю, что при обычном, не автоматизированном, выполнении этой процедуры было источником ошибок (Р.А. Авдеева, Л.П. Лаврова [5]).

В аппаратах «Групаматик» успешно применяются те же методы, что и в аппаратах «Техникой»: бромелинметилцеллюлозная техника (Garetta и соавт. [297]), трипсин-полибренцитратная техника (Confida и соавт. [235]), антигаобулиновый метод (Matte [466]), реакция конглютинации в коллоидных средах (Habibi и соавт. [333]). Базовой серологической методикой приборов «Групаматик» является бромелиновая техника, обеспечивающая оптимальное определение наиболее значимых факторов в клиниче­ской трансфузиологии - группы крови АВО и резус-принадлежности (Haahty [330], O.K. Гаврилов и др. [25], Р.А. Авдеева и др. [4,5], Л.П. Лаврова и др. [73,74]).

Приборы «Групаматик» нашли применение в США, Англии, Японии, Швеции, Австрии. По своим техническим характеристикам - пропускной спо­собности, чувствительности реакций, надежности получаемых результатов -они выгодно отличались от других автоматов (Soustelle и соавт. [623]).

Известны модификации приборов для определения групп крови: «мини-Групаматик» (Reviel, Emblin [562]) и варианты прибора «Техникой» (Severns и соавт. [603]), позволяющие выполнять реакцию в микроплатах, что существен­но сокращает расход реагентов (Descamps и соавт. [260]).

Обращает на себя внимание предложенный в 1986 г. метод агглютинации в геле [261], который представляет собой комбинацию двух методов: агглютина­ции и гель-фильтрации*.

Попытки создания автоматических анализаторов групп крови были предпри­няты и в нашей стране. В 1990 г. в Гематологическом научном центре Российский Академии медицинских наук совместно с научно-исследовательским и конструк­торским институтом медицинской лабораторной техники Минмедпрома СССР был разработан и успешно прошел лабораторные испытания первый отечествен­ный анализатор групп крови - АГК-01 (А.Н. Алипов и др. [7], Р.С. Каландаров [63]). Прибор представлял собой полуавтоматическую систему, в которой были автоматизированы отдельные этапы реакции: разведение пробы, перемешивание

Метод подробно описан в книге А.А. Рагимова и Н.Г. Дашковой: «Основы трансфузион-ной иммунологии» [91].

нгредиентов реакции (эритроцитов и сывороток), центрифугирование смеси, учет результатов реакции, вывод результатов на печать. Производительность при­бора - 48 образцов крови в час.

По нашему мнению, реакция агглютинации эритроцитов как специфический фе­номен - быстропротекающий процесс, имеющий сложные био-физико-химические составляющие. Этот взгляд нашел подтверждение в работах Р.С. Каландарова [63], а также других авторов (Wardlaw и соавт. [698], B.C. Андреев [8]).

Поиск новых физических принципов оценки реакции агтлютинации представляет чрезвычайный интерес для теории и практики иммуносерологических исследований.

В последние годы получены интересные данные о своеобразном действии ультразвука на взвесь корпускулярных частиц (Н.Н. Князьков [65]). Ультразвук нарушает суспензионную стабильность эритроцитов и приводит к их быстрому оседанию (СИ. Донсков и др. [43], Р.С. Каландаров и др. [63,64]).

В течение нескольких секунд после подачи ультразвука взвесь эритроцитов расслаивается, образуются видимые агрегаты эритроцитов, которые после от­ключения ультразвука начинают быстро оседать на дно пробирки. Как отмеча­ют Н.Н. Князьков [65] и Р.С. Каландаров [63], ультразвук может найти примене­ние в анализаторах серологических реакций нового поколения.

В последние годы Narayanan и соавт. [503] разработали новую технологию типирования крови, основанную на спектроскопии в видимой и ультрафиолето­вой части спектра. Группу крови определяют по изменению оптической плотно­сти взвеси эритроцитов в присутствии агглютинирующих антител. Оптическая плотность ниже 665 нм соответствует отрицательному результату, выше 1000 нм - положительному. С помощью этого метода удалось с достаточно вы­сокой степенью совпадения определять группу крови и резус-принадлежность.

Несмотря на очевидные успехи в развитии автоматизированных серологических методов исследования, возможности их совершенствования далеко не исчерпаны.

Идеология конструирования анализаторов серологических реакций пер­вого поколения (приборы «Техникой», «Групаматик», «Контифло») бази­ровалась на принципе полной автоматизации без участия оператора, что­бы исключить ошибки, связанные с так называемым человеческим факто­ром. Процесс определения, согласно этой идеологии, должен быть поточным (конвейерным) и по возможности универсальным, пригодным для определе­ния максимального спектра антигенов и антител, отличающихся своими се­рологическими и физико-химическими характеристиками. Такое оборудова­ние предназначалось для крупных банков крови, имеющих огромную произ­водительность. Однако за всем этим не усматривались потребности неболь­ших, но наиболее многочисленных, особенно для Российской Федерации, структуру- отделений и кабинетов переливания крови. Их в Российской Федерации насчитывается более 1000.

Специальное малогабаритное оборудование разработанное Н.И. Васильевым |24}, адаптировано для проведения пробы на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента в условиях отделения переливания крови, в непо­средственной близости от постели больного.

Категория: Система RH

Опубликовано: 19 апреля 2014

Для производства моноклональных антител применяют метод гибридизации иммунных лимфоцитов (полученных от иммунизированных людей) с клетками мышиной миеломы или трансформации иммунных лимфоцитов вирусами. Вместо миеломных клеток мыши используют также лимфобластоидные клеточные линии человека. Гетеро- и аллогибридомы обладают способностью к самоподдержанию, присущей опухолевым клеткам, и одновременно способностью продуцировать ан­титела. Существует несколько способов гибридизации иммунных лимфоцитов:

• прямая гибридизация, когда лимфоциты иммунизированного лица сли­вают с клетками миеломы в расчете, что среди слившихся клеток мо­гут оказаться лимфобласты, продуцирующие моноклональные антите­ла. Этот способ менее эффективен, поскольку вероятность слияния опу­холевых и антителопродуцирующих клеток очень мала;
• реиммунизация in vitro, когда перед слиянием с миеломными клетками им­мунные лимфоциты выдерживают с эритроцитами, содержащими соответ­ствующий антиген, то есть иммунизируют их вторично. Этот прием позво­ляет повысить концентрацию лимфобластов или лимфобластоподобных клеток во взвеси иммунных лимфоцитов и таким образом увеличить веро­ятность получения требуемого гибрвда-продуцента;
• трансформация иммунных лимфоцитов вирусом Эпштейна - Барр. Этот способ не требует использования мышиной миеломы. Эффект превраще­ния короткоживущих иммунных лимфоцитов в самоподдерживающуюся линию достигается тем, что встроившийся в геном клетки вирус придает ей способность к безудержной пролиферации.

Вирусную трансформацию лимфоцитов, придающую им опухолегенные, ма-лигнизирующие свойства, можно рассматривать как своеобразную гибридиза­цию ДНК лимфоцитов и ДНК вирусов. В результате такой гибридизации лим­фоциты или лимфобластоподобные клетки преодолевают апоптоз (управляе­мую гибель клеток) и становятся практически бессмертными#

Первые моноклональные анти-О-антитела были получены Вгоп и соавт. [184], Lowe и соавт. [450], Thompson и соавт. [652] и другими авторами [291,
402, 555]. Вскоре были получены антитела анти-С [651], анти-с [555, 651], анти-Е [651], анти-е [182, 292, 651], анти-G [290, 651], aHTH-C^w [653], анти- Rhl7, анти-Ю129 и анти-Ю146 [580,659].

Первые в России моноклональные антитела анти-D и анти-DC полу­чены в Центральном НИИ гематологии и переливания крови профессо­ром И.Л. Чертковым с сотрудниками [17,18, 31].

И.В. Дубинкиным с соавт. получены штаммы гетерогибридом человек х мышь, продуцирующие моноклональные антитела к антигенам D, с, C^w, Е и др., пригод­ные для промышленного производства диагностических реагентов [51,52,53].

Для этого лимфоциты периферической крови доноров, продуцирующих соответ­ствующие антитела, гибридизировали с клетками мышиной миеломы Х-63 и NS1.

Полученные антитела тестировали по панели стандартных эритроцитов ГНЦ РАМН (табл. 4.40). Класс иммуноглобулинов устанавливали с помощью мы­шиных моноклональных антител к иммуноглобулинам человека в реакции не­прямой иммунофлюоресценции. Титр антител определяли посредством реак­ции в солевой и коллоидной среде, а также непрямой реакции Кумбса в зависи­мости от принадлежности антител к тому или иному классу иммуноглобулинов (табл. 4.41).

Таблица 4.40

Протокол испытания моноклональных антител со стандартными эритроцитами

Оптимальным разводителем моноклональных антител анти-Rh, позво­лившим получать активные и специфичные тестовые реагенты, явились рас­творы с низкой ионной силой в комбинации с коллоидами полисахаридной природы. В настоящее время эти реагенты широко применяют в лечебно-профилактических учреждениях.

Характеристика моноклональных антител

Категория: Система RH

Опубликовано: 19 апреля 2014

Landsteiner и Wiener [408] и усовершенствован Boorman, Dodd и Mollison [179]. В СССР метод агглютинации в солевой среде был внедрен в Центральном ин­ституте переливания крови М.А. Умновой [113] и его применяют до настояще­го времени.

Метод отличается точностью и четкостью результатов, однако при его вы­полнении необходимо отмывать исследуемые эритроциты, готовить из них взвеси и длительно (1ч) инкубировать взвеси с сывороткой. Перечисленные ма­нипуляции требуют специального оснащения: термостата, центрифуги, микро­пробирок, что усложняет исследование и увеличивает его продолжительность.

В связи с этим усилия многих исследователей были направлены на упроще­ние этого метода. Однако многочисленные модификации метода солевой агглю­тинации, в частности капиллярные методики (Chown [215], Chown, Lewis [217, 220]), пробы с применением центрифугирования (Poole, Williams [534], Harvey [337], Majsky [455]) или выполняемые на плоскости (Wootton [723]), были по существу сведены к упрощению отдельных технических элементов. В целом же определение резус-фактора этим методом продолжает оставаться до настояще­го времени относительно сложным и продолжительным лабораторным исследо­ванием. К этому следует добавить и то обстоятельство, что сыворотки с полны­ми антителами, необходимые для метода агглютинации в солевой среде, редко встречаются и их количество ограничено. Однако с внедрением технологий по­лучения моноклональных антител это ограничение было снято.

Более перспективными оказались методы, включающие использование сы­вороток с неполными антителами. Благодаря относительной простоте и доступ­ности тестовых сывороток они нашли широкое применение как за рубежом, так и в России.

Наибольший практический интерес из этой группы методов представляют конглютинационные пробы, основанные на использовании различных коллоид­ных жидкостей, которые либо добавляют к тестовой сыворотке, либо взвешива­ют в них исследуемые эритроциты.

Первая конглютинационная проба с применением в качестве коллоидной среды плазмы крови была предложена Diamond и Abelson [262].

В СССР аналогичный метод был разработан независимо от указанных выше авторов в Ленинградском институте переливания крови Н.И. Блиновым и Н.Д. Дробышевой [21] и впоследствии усовершенствован Т.Г. Соловьевой [104]. Этот метод, получивший название - определение резус-фактора в сывороточ­ной среде на чашках Петри, основан на использовании эритроцитов, взвешен­ных в собственной сыворотке. Взвесь эритроцитов и тестовых сывороток нано­сят на чашку Петри, которую затем помещают в водяную баню при температу­ре 45-48 °С. Результат учитывают после 10-минутной инкубации взвеси по на­личию или отсутствию агглютинации эритроцитов. «Чашечный» метод прост и удобен, однако его недостатком является невозможность исследования свежей цельной крови, так как в условиях указанной температуры она свертывается.

я устранения этого недостатка E.G. Копосов [67, 68] рекомендовал ис­пользовать смесь свежей цельной крови с одногруппной стандартной изогемаг-глютинирующей сывороткой.

А.Я. Ашкенази [13] предложила другой, более удачный, прием устранения отмеченного недостатка «чашечного» метода. Автор рекомендовала добавлять в тестовую сыворотку гепарин, что позволило определять резус-фактор свежей крови, взятой непосредственно от обследуемого. Тем не менее «чашечный» ме­тод, так же как и другие конглютинационные пробы, основанные на использо­вании плазмы или сыворотки, нуждался в существенной доработке. Дело в том, что плазма и сыворотка, в которой взвешивают исследуемые эритроциты, об­ладают относительно низкой конглютинационной активностью, в силу чего аг­глютинация эритроцитов в большинстве случаев выражена недостаточно силь­но. Поиски коллоидных сред с более выраженными конглютинационными свой­ствами привели исследователей к использованию других естественных и синте­тических коллоидов.

Diamond и Denton [263] впервые отметили, что агглютинация эритроцитов выражена в значительно большой степени, если плазму, в которой они были взвешены, заменить раствором альбумина. Позднее эти данные были подтверждены, и альбумин стал широко применяться при определении резус-фактора (Р.М. Уринсон [118], Tuck [663], Stratton [633], Lawrence [414]).                                                                                                                                                                                                                                                     

Fisk и Мс Gee [286] обратили внимание на высокие конглютинационные свойства раствора желатина и предложили использовать его в качестве кол­лоидной среды при определении резус-фактора и выявлении неполных резус-антител. Впоследствии этот метод был модифицирован А.Г. Башлай [15] и до настоящего времени с успехом применяется во многих серологических лабора­ториях Российской Федерации.

О.В. Успенская [123] привела данные, свидетельствующие о том, что приме­нение раствора желатины при определении резус-фактора позволяет сократить продолжительность этого исследования.

Grubb [324], изучая конглютинационные свойства синтетического плазмоза-менителя - декстрана, показал, что титры сывороток антирезус при разведении их декстраном значительно превышают результаты титрования в изотоническом растворе натрия хлорида.

Продолжая начатые Grubb исследования, Jones [382] и Bonnel [178] устано­вили, что декстран по сравнению с изогемагглютинирующими сыворотками и альбумином также обладает более выраженными конглютинационными свой­ствами.

И.И. Забалуева [54], изучив конглютинационные свойства декстрана, указа­ла на возможность его применения в качестве стандартного разводителя, позво­ляющего увеличить ресурсы дефицитных сывороток антирезус. Кроме того, ис­пользование декстрана при определении резус-фактора значительно повысило демонстративность реакции (А.Я. Ашкенази [9], О.В. Успенская [123]).

Наряду с перечисленными коллоидами широкое применение в серологиче­ских реакциях нашел также другой синтетический плазмозаменитель - поливи-нилпирролидон, который не уступает по своим конглютинационным свойствам растворам декстрана (McNeil, Trentelman [474], Stroje и соавт. [637]).

Замена плазмы другими коллоидными разводителями позволила существен­но улучшить качество конглютинационных методов, в частности повысить чет­кость результатов исследования, сократить его продолжительность.

Дальнейшее совершенствование конглютинационных проб способствовало созданию методов, пригодных для определения резус-фактора без нагреватель­ных приборов. Интересные данные получили Eldon [273] и Drachmann [264], Они показали, что сыворотки антирезус, разведенные высокомолекулярным декстраном, приобретают способность специфически агглютинировать эритро­циты в условиях комнатной температуры.

Вслед за этим были предложены методы определения резус-фактора без подогрева с использованием альбумина (Murray [499]; Hrubisko, Hrabinska [354]; Sturgeon [640]) и гепарина (А.Я. Ашкенази [13]; Daszynski [250]). Наи­больший практический интерес представляет метод, разработанный Hrubisko и Hrabinska. При определении резус-фактора этим методом каплю тестовой сы­воротки в комбинации с альбумином наносят на предметное стекло и добавля­ют 5-10% взвесь эритроцитов в собственной сыворотке. Стекло оставляют на 10 мин при комнатной температуре, после чего учитывают результат.

Таким образом, применение коллоидных растворов с более выраженным, чем у плазмы, конглютинационными свойствами позволило не только сократить продолжительность определения резус-фактора и повысить четкость результа­тов этого исследования, но и существенно упростить его.

Нами совместно с P.M. Уринсон и Е.А. Зотиковым [34, 49] был разработан экспресс-метод определения резус-фактора на плоскости без подогрева, осно­ванный на использовании сывороток антирезус в комбинации с альбумином или полиглюкином. Этот метод позволил определять одновременно резус-фактор, его разновидности и группу крови. Благодаря своей простоте и доступности он широко применялся в лечебно-профилактических учреждениях России в пери­од с 1966 г. до конца 1980-х гг., пока не уступил место еще более простым мето­дам с использованием моноклональных антител.

Также перспективным в плане разработки более совершенных методов опре­деления резус-фактора оказалось еще одно направление, а именно использова­ние в серологических реакциях протеолитических ферментов.

Первые сообщения о принципе ускорения реакции антиген - антитело с помо­щью ферментов появилось в 1946-1947 гг. (Pickles [525], Morton, Pickles [490]). Вскоре после этого различными авторами был предложен целый ряд серологиче­ских методов выявления антигенов и антител с использованием протеолитических ферментов животного, растительного и бактериального происхождения: трипсина (Morton, Pickles [489], Willert [718], Young [727]), папаина (Lov [449], Gilbey [303]),

бромелина (Pirofsky и соавт. [528], Moore и соавт. [479], Majsky [456]), протелина (Р.С. Сахаров [95]), фицина (СИ. Донсков [36]) и других ферментов.

Разработка этих методов имела большое практическое значение, так как по­зволила повысить чувствительность реакции. Более того, с помощью фермен­тов некоторым авторам удалось создать методы определения резус-фактора, не требующие нагревательных приборов (Р.С. Сахаров [95], СИ. Донсков [36]).

При определении резус-фактора методом, разработанным Hekker с соавт. [344], тестовую сыворотку, папаин, активированный солянокислым цистеином, и взвесь исследуемых эритроцитов наносят на предметное стекло и выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре. После этого стекло покачивают и учитывают результат. Morganti [488] и Esche [274] дали высокую оценку этому методу, подчеркивая его быстроту и наглядность результатов. То же самое можно сказать о методе, предложенном Tribedi, Crosbie [662] и Р.С. Сахаровым [95].

Таким образом, была показана принципиальная возможность определения резус-фактора с помощью сывороток в сочетании с высокомолекулярными кол­лоидами или протеолитическими ферментами и созданы первые методы, такие же быстрые, удобные и простые как определение группы крови.

Категория: Система RH

Опубликовано: 19 апреля 2014

Смешивание и разведение сывороток в практике серологических лабораторий применяют очень широко. Это делают с целью утилизировать сыворотки с отно­сительно низким титром антител, повысить их активность и специфичность, уве­личить объем серии. Кроме того, упрощается контроль серий стандартных сыво­роток, полученных из нескольких небольших порций исходного сырья.

В отношении смешивания изогемагглютинирующих сывороток мнения ав­торов расходятся. Так, В.Н. Краинская-Игнатова [72], Б.А. Вартапетов [23], Т.Г. Соловьева [102] считали, что при смешивании нескольких образцов сыво­роток конечный титр изогемагглютининов выше среднеарифметического. По данным P.M. Уринсон [118], титр смесей не повышается и равен среднеарифме­тическому.

В противоположность этому И. Мишенин и Г. Иванихенко [81] привели дан­ные о том, что титр смесей снижается и быстро падает в процессе их хранения.

А.А. Тарасевич [107] на основании своих исследований пришла к выводу, что при смешивании изогемагглютинирующих сывороток титр смеси может со­ответствовать среднеарифметическому, быть выше или ниже его.

Большинство авторов сходятся во мнении о необходимости смешивания сы­вороток антирезус и их разведения (Л.В. Буренкова [22], P.M. Уринсон [119], А.Я. Ашкенази [10], Т.М. Сафронова [94], Ф.А. Траулько [109]).

С одной стороны, это позволяет повысить их активность и титр по срав­нению с исходным, с другой - увеличить количество стандартной сыворотки (А.Я. Ашкенази [9]). Однако в этом есть свои особенности.

Многочисленные исследователи, применявшие для разведения сывороток антирезус плазму и сыворотку AB(IV), отмечают, что разные образцы плазмы и сывороток AB(IV) неодинаково активируют одну и ту же антирезусную сыво­ротку. Так, Spielmann [625] при титровании резус-антител в нескольких образ­цах изогемагглютинирующих сывороток получил разницу в титре на 4 ступени.

А.Я. Ашкенази [9,10] отметила, что титры резус-антител при разведении сыворотки антирезус разными сериями сывороток АВ могут колебаться от 1 : 4 до 1 : 1024.

Аналогичные результаты были получены также О.В. Успенской [123] и Т.Г. Соловьевой [104].

Таким образом, конглютинационные свойства сывороток-разводителей, чаще группы AB(IV), сильно колеблются.

Spielmann [625] связывает это с различной концентрацией белка в сыворот­ках. Особенно низкий титр автор получил при разведении сыворотки антирезус сывороткой больной, страдающей гипопротеинемией.

Однако вряд ли можно объяснить разницу в титре на 4-8 ступеней только разной концентрацией белка в сыворотках-разводителях. По-видимому, в этих случаях имеют место какие-то более тонкие механизмы, воздействующие на ре­акцию антиген - антитело, возможно, эндогенные ингибиторы антител.

Другая коллоидная среда - декстран - обладает более стабильными конглютинационными свойствами (ПЛ. Забалуева [54], Ф.А. Траулько [109], А.Я. Ашкенази [11], О.В. Успенская [123], А.Е. Скудицкий [1011]), поэтому его применяют вплоть до настоящего времени очень широко. Конглютинационная активность декстрана значительно выше, чем сывороток AB(IV), что позволило использовать декстран для получения большого количества тестовых сывороток антирезус их разведением (Ф.А. Траулько [109], О.В. Успенская [123], СИ. Донсков [36]).

Большим достижением в прикладной иммуносерологии явились исследо­вания Eldon [273], который установил, что сыворотки антирезус, разведенные высокомолекулярным декстраном, могут быть использованы для определения резус-фактора на плоскости при комнатной температуре. До работ Eldon имму-носерологи полагали, что резус-антитела, будучи иммунными, имеют темпера­турный оптимум реагирования 37 °С и по определению не могут реагировать при комнатной температуре, 20-22 °С

Дальнейшие исследования, проведенные в этом направлении Hrubicko, Hrabinska [354], СИ. Донсковым [36], показали, что определять резус-фактор и его разновидности можно при комнатной температуре, если в сыворотки анти­резус добавить концентрированный раствор альбумина или полиглюкина.

Аналогичные результаты были получены Daszynski [250] и А.Я. Ашкенази [И] при использовании сывороток в комбинации с гепарином. Однако, как от­мечает Daszynski, метод определения резус-фактора гепаринизированными сы­воротками не достаточно чувствителен.

Таким образом, было положено начало способам приготовления тесто­вых сывороток, пригодных для определения резус-фактора на плоскости при комнатной температуре, и появилась перспектива разработки методов, ко­торые позволяли объединить определение группы крови и резус-фактора в один процесс [36].

Категория: Система RH

Опубликовано: 19 апреля 2014

С 1956 г., по данным Т.Г. Соловьевой [103], в нашей стране стали широко применять изоиммунные сыворотки антирезус, которые в значительной степени лишены указанных выше недостатков. Источником их получения служат резус-отрицательные лица, перенесшие посттрансфузионные осложнения, связанные с переливанием резус-положительной крови, или резус-отрицательные женщи­ны, сенсибилизированные к резус-антигену в результате беременностей.

Однако количество тестовых сывороток, получаемых из этих источников, не удовлетворяло растущей потребности лечебных учреждений в этих диагно­стических реактивах, а также в сырье для приготовления иммуноглобулина анти-D с целью профилактики ГБН. С начала 1960-х годов в России стали при­менять искусственную иммунизацию доноров, что позволило получать высоко­активные антирезусные сыворотки в достаточном количестве (Т.Г. Соловьева, М.Б. Мамедова [105], P.M. Уринсон, СБ. Скопина [122]).

Свойства тестовых сывороток антирезус

К общим свойствам сывороток антирезус относят их специфичность, актив­ность и титр.

Свежезаготовленные нативные сыворотки крови в большинстве случаев вы­зывают неспецифическую агрегацию эритроцитов независимо от групповой и резус-принадлежности лиц, от которых они получены. В связи с этим сыворот­ки необходимо выдерживать до тех пор, пока они не утратят эту способность. Для изогемагглютинирующих сывороток этот срок варьирует в пределах 3 не­дель (P.M. Уринсон [118]); антирезусные сыворотки утрачивают панагглютина­ционные свойства в течение нескольких суток.

Для устранения панагглютинационных свойств антирезусных сывороток применяли прогревание их в термостате в течение 15-20 ч (Т.Г. Соловьева) или разведение сыворотками АВ (О.В. Успенская [123], Т.Г. Соловьева [103]).

Другое свойство сывороток антирезус - их активность (авидность), характе­ризуется скоростью появления агглютинации эритроцитов, а также величиной агглютинатов. Для изогемагглютинирующих сывороток эти показатели относи­тельно постоянны, за исключением случаев замедленной агглютинации эритро­цитов со слабым А₂-антигеном.

Активность сывороток антирезус зависит от целого ряда причин: методики использования, коллоидного разводителя, степени разведения сыворотки и др.

Титр сывороток, который также является показателем их активности, должен быть не ниже 1 : 64 [61].

Однако титр и активность сывороток не всегда взаимосвязаны. А.Я. Ашкенази [9] отмечает, что некоторые сыворотки с относительно низким титром резус-антител вызывают крупную агглютинацию эритроцитов и вполне могут быть использованы в качестве стандартных. Таким образом, при 6ф боре сывороток в качестве тестовых решающим моментом является их авид-ность.