Долгое время химическая структура антигенов Rh оставалась загадкой. Многочисленные попытки выделить этот антиген в чистом виде и проверить его серологические свойства резус-антителами были безуспешными. Высказывалось суждение о том, что этот антиген в серологически активном виде не может существовать вне клеточной мембраны и, будучи выделенным из нее, тотчас инакти-вируется. Такое мнение поддерживалось сведениями о том, что нагревание и высушивание эритроцитов снижают серологическую активность антигенов Rh.
Разработка адекватных методов исследования гидрофобных структур мембраны эритроцитов дала существенный сдвиг в этой области. Появились сообщения Green [316] о том, что экспрессия антигенов D и С на эритроцитах связана с тиоловыми группами, и, следовательно, эти антигены по своей природе относятся к белкам, а не к полисахаридам, как считали раньше по аналогии с полисахаридами А и В.
Использование глутатионмалеимидмембранных зондов также указывало на причастность экзофациальных тиоловых групп к D-специфичности. Однако значение свободных тиоловых групп в формировании антигенов Rh было поставлено под сомнение Suyama и соавт. [646].
Далее было показано (Green [315]), что липидные фракции, экстрагированные из стромы эритроцитов n-бутанолом, а также получаемый при этом нерастворимый белковый осадок не обладают серологической активностью по отдельности, но при объединении этих фракций специфическая D-активность субстрата вновь проявляется. Таким образом, стала проясняться белково-липидная природа субстанции Rh.
Hughes-Jones и соавт. [366] подтвердили, что основными компонентами, необходимыми для экспрессии антигена D, являются фосфолипиды, поскольку обработка мембран эритроцитов фосфолипазами А2 и С инактивировала антигены D, Сс и Ее. Интересная деталь: как было установлено Hughes-Jones и соавт. [366], Green и соавт. [320], анти-Э-антитела, адсорбированные на эритроцитах D+, предотвращали инактивацию антигена D фосфолипазой А2, что указывало на специфичность воздействия этого фермента именно на структуру-носитель антигена D.
Попытки выделить и идентифицировать белок Rh, предпринятые до 1980-х годов, позволили составить общую физико-химическую характеристику антигенов Rh. Предварительно установлено, что белок D имеет мол. массу 7-10 кДа. Другие исследователи сообщили, что антигены Rh расположены на анионном транспортном белке в полосе 3 [678]. Полоса 3, как теперь известно, соответствует антигенам Diego. Впоследствии полученные результаты были объяснены излишним протеолизом полипептидов D при очистке, а также тем фактом, что оба белка одинаково гидрофобны и мигрируют вместе в процессе выделения из мембраны эритроцитов.
Прорыв в исследовании антигенов Rh произошел в начале 1980-х годов, когда появились методы выделения растворимых комплексов «D-aura-D» имму-нопреципитацией антигенов специфическими антителами, меченными радиоактивным йодом (Moore и соавт. [483], Ridgwell и соавт. [564]). Вскоре были идентифицированы полипептиды с мол. массой 32-34 кДа, несущие серологическую активность D, Сс и Ее, и отсутствовашие на эритроцитах Rhnu!1. Каждый полипептид содержал экзофациальные тиоловые группы [564].
Далее выяснилось, что антигены е и Е расположены на одном полипептиде, а антиген D - на другом.
Картирование Rh-полипептидов, проведенное Bloy и соавт. [172], Blanchard и соавт. [168], показало, что фракции, иммунопреципитированные сыворотками анти-с и анти-Е, практически идентичны, а фракции, иммуно-преципитированные сыворотками анти-D, существенно от них отличаются.
Hughes-Jones и соавт. [363] не наблюдали конкурентного подавления связывания анти-с-антител антителами анти-Е и анти-D, а также ингибиции связывания анти-Е-антител антителами анти-с и анти-D, что свидетельствовало о размещении антигенов D, с и Е на разных участках полипептидов. При картировании установлено, что полипептид D имеет отличительные участки, не характерные для полипептидов с и Е, и это полностью совпало с результатами иммунопреципитации.
Gahmberg [295] отметил, что полипептид D не содержит углеводов в отличие от других белков, расположенных на внеклеточной поверхности мембраны эритроцитов. Такое заключение было основано на невозможности пометить полипептид D галактозоксидазой и перийодатом, неспособностью очищенного полипептида связываться в лектиновых колонках, а также неэффективностью обработки эндо-1М-ацетилглютаминазой Н и эндо-|3-галактозидазой.
Гликозилирование как обычная составляющая синтеза мембранных элементов не характерно для белка Rh. Он собирается в виде комплекса, включающего готовые полипептиды Rh и гликопротеины Rh, причем полипептиды Rh являются продуктом одного гена, расположенного на хромосоме 1, а гликопротеины Rh - продуктом другого гена, расположенного на хромосоме 6. Точно так же собираются антигены системы Kell: белок Кх ковалентно связывается с гликозили-рованным гликопротеином Kell, но оба субстрата являются продуктами разных генов, один из которых расположен на аутосоме, другой (Кх - на хромосоме X.)
После того как полипептиды Rh были идентифицированы, несколько групп исследователей попытались изучить их аминокислотную последовательность, а также создать олигонуклеотидные зонды и выделить ДНК, кодирующую Rh. Наиболее эффективными оказались методы препаративной иммунопреципитации (Avent и соавт. [147], Bloy и соавт. [172] с использованием мышиных и человеческих моноклональных антител. Другие исследователи (Saboori и соавт. [590]) использовали для очистки белков неиммунологические методы, в частности хроматографию в гидроксиапатите кальция (Saboori и соавт. [589]). Очищенные полипептиды метили радиоактивным йодом и расщепляли химотрипсином.
Исследования показали, что полипептид Rh, преципитированный анти-D-антителами, имел ту же N-концевую последовательность (до остатка 13), что и полипептид Rh, преципитированный мышиными моноклональными антителами серии R6A [147]. Однако, поскольку антитела R6A реагировали с эритроцитами D—, следовал вывод, что антиген D находится на другом полипептиде, реагирующем с анти-О-антителами, и что анти-О-антитела человека и моноклональные антитела R6A мыши определяют 2 разных, но тесно связанных полипептида. Исследование аминокислотной последовательности белков, выделенных хроматографией в гидроксиапатите из клеток D+ и D-, подтвердило их сходство
Предположение о том, что полипептиды Rh могут быть связаны в мембране эритроцитов с гликозилированным компонентом (гликопротеин Rh), было впервые высказано Gahmberg [295]. Далее было установлено, что гликопротеин Rh, преципитированный анти-Б-антителами вместе с полипептидом Rh, имеет мол. массу 45-70 кДа, а полипептид Rh - 30 кДа.
Когда стало ясно, что полипептиды Rh связаны в клеточной мембране с гли-копротеинами Rh, появились высказывания, что одни антигены Rh могут быть экспрессированы на полипептиде, а другие - на гликопротеине. Не исключали и третий вариант: некоторые антигены Rh представляют собой комплекс, состоящий из участков полипептида и гликопротеина. Присутствуя порознь, эти участки полипептида и гликопротеина не являются иммуногенными, а когда присутствуют одновременно, их комплекс приобретает иммуногенность.
Однако в последующих работах было установлено, что белковые последовательности, определяющие специфичность антигенов Rh, расположены на полипептидах, а не на гликопротеинах.
