Для определения антигенов и антител системы резус известен целый ряд различных методов (табл. 4.39). Все методы с их многочисленными модификациями можно разделить на 2 большие группы: методы, включающие использование тестовых сывороток с полными антителами и основанные на применении сывороток, содержащих неполные резус-антитела.
Таблица 4.39
Методы определения антигенов и антител системы резус
Реакция солевой агглютинации (Landsteiner, Wiener [408]) Конглютинационные пробы
- на чашках Петри (Блинов Н.И., Дробышева Н.С. [21])
- на подносах (Успенская О.В. [123])
- в пробирках с желатином (Башлай А.Г. [14])
- в пробирках с 33% полиглюкином (Михайлова А.А. [79])
- с гепарином (Ашкенази А.Я. [9])
- с композитом коллоидов (Траулько Ф.А. [109])
- экспресс-метод на плоскости (Донсков СИ. [36]) Ферментные методы
- с фицином (Донсков СИ. [36])
- с протелином (Сахаров Р.С [95])
- с трипсином (Dausset, Widal [253]) Антиглобулиновые пробы
- непрямая проба Кумбса (Coombs, Mourant, Race [238])
- двойной Кумбс (Зотиков Е.А. и др.)
- Кумбс-фермент (Unger и Katz [667])
- адсорбция - элюция (Weiner [700])
- потребление антиглобулина
Карточки для определения групп крови (Элдон [273]) (Донсков СИ. [36])
Инструментальные методы
- Групаматик (Франция)
- Техникой (США)
- Контифло (Румыния)
- АГК-01 (Алипов А.Н. и др. [7])
- гелевые технологии ДиаМед (Швейцария),
ОртоБайоВью (Англия), Скангель, Биорад (Франция) Медиком, GRIFOLS (Испания) Молекулярно-биологические методы
- полимеразная цепная реакция
- Саузерн-блот
Вторая, наиболее многочисленная, группа методов может быть подразделена на 3 подгруппы: конглютинационные, антиглобулиновые и ферментные.
В качестве самостоятельной группы следует выделить методы с использованием специальных карточек с высушенными на них тестовыми реактивами. Перед исследованием высушенные реагенты растворяют каплями воды и проводят определение как на плоскости.
Отдельные группы составляют инструментальные методы - анализаторы групп крови, а также молекулярно-биологические технологии.
По оснащению и технике выполнения методы можно разделить на пробирочные, капиллярные и выполняемые на плоскости.
В первые годы после открытия резус-фактора его определяли с помощью агглютинации в солевой среде, основанной на использовании сывороток, содержащих полные антирезус-антитела. Этот метод был разработан в 1941 г.
Landsteiner и Wiener [408] и усовершенствован Boorman, Dodd и Mollison [179]. В СССР метод агглютинации в солевой среде был внедрен в Центральном институте переливания крови М.А. Умновой [113] и его применяют до настоящего времени.
Метод отличается точностью и четкостью результатов, однако при его выполнении необходимо отмывать исследуемые эритроциты, готовить из них взвеси и длительно (1ч) инкубировать взвеси с сывороткой. Перечисленные манипуляции требуют специального оснащения: термостата, центрифуги, микропробирок, что усложняет исследование и увеличивает его продолжительность.
В связи с этим усилия многих исследователей были направлены на упрощение этого метода. Однако многочисленные модификации метода солевой агглютинации, в частности капиллярные методики (Chown [215], Chown, Lewis [217, 220]), пробы с применением центрифугирования (Poole, Williams [534], Harvey [337], Majsky [455]) или выполняемые на плоскости (Wootton [723]), были по существу сведены к упрощению отдельных технических элементов. В целом же определение резус-фактора этим методом продолжает оставаться до настоящего времени относительно сложным и продолжительным лабораторным исследованием. К этому следует добавить и то обстоятельство, что сыворотки с полными антителами, необходимые для метода агглютинации в солевой среде, редко встречаются и их количество ограничено. Однако с внедрением технологий получения моноклональных антител это ограничение было снято.
Более перспективными оказались методы, включающие использование сывороток с неполными антителами. Благодаря относительной простоте и доступности тестовых сывороток они нашли широкое применение как за рубежом, так и в России.
Наибольший практический интерес из этой группы методов представляют конглютинационные пробы, основанные на использовании различных коллоидных жидкостей, которые либо добавляют к тестовой сыворотке, либо взвешивают в них исследуемые эритроциты.
Первая конглютинационная проба с применением в качестве коллоидной среды плазмы крови была предложена Diamond и Abelson [262].
В СССР аналогичный метод был разработан независимо от указанных выше авторов в Ленинградском институте переливания крови Н.И. Блиновым и Н.Д. Дробышевой [21] и впоследствии усовершенствован Т.Г. Соловьевой [104]. Этот метод, получивший название - определение резус-фактора в сывороточной среде на чашках Петри, основан на использовании эритроцитов, взвешенных в собственной сыворотке. Взвесь эритроцитов и тестовых сывороток наносят на чашку Петри, которую затем помещают в водяную баню при температуре 45-48 °С. Результат учитывают после 10-минутной инкубации взвеси по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов. «Чашечный» метод прост и удобен, однако его недостатком является невозможность исследования свежей цельной крови, так как в условиях указанной температуры она свертывается.
я устранения этого недостатка E.G. Копосов [67, 68] рекомендовал использовать смесь свежей цельной крови с одногруппной стандартной изогемаг-глютинирующей сывороткой.
А.Я. Ашкенази [13] предложила другой, более удачный, прием устранения отмеченного недостатка «чашечного» метода. Автор рекомендовала добавлять в тестовую сыворотку гепарин, что позволило определять резус-фактор свежей крови, взятой непосредственно от обследуемого. Тем не менее «чашечный» метод, так же как и другие конглютинационные пробы, основанные на использовании плазмы или сыворотки, нуждался в существенной доработке. Дело в том, что плазма и сыворотка, в которой взвешивают исследуемые эритроциты, обладают относительно низкой конглютинационной активностью, в силу чего агглютинация эритроцитов в большинстве случаев выражена недостаточно сильно. Поиски коллоидных сред с более выраженными конглютинационными свойствами привели исследователей к использованию других естественных и синтетических коллоидов.
Diamond и Denton [263] впервые отметили, что агглютинация эритроцитов выражена в значительно большой степени, если плазму, в которой они были взвешены, заменить раствором альбумина. Позднее эти данные были подтверждены, и альбумин стал широко применяться при определении резус-фактора (Р.М. Уринсон [118], Tuck [663], Stratton [633], Lawrence [414]).
Fisk и Мс Gee [286] обратили внимание на высокие конглютинационные свойства раствора желатина и предложили использовать его в качестве коллоидной среды при определении резус-фактора и выявлении неполных резус-антител. Впоследствии этот метод был модифицирован А.Г. Башлай [15] и до настоящего времени с успехом применяется во многих серологических лабораториях Российской Федерации.
О.В. Успенская [123] привела данные, свидетельствующие о том, что применение раствора желатины при определении резус-фактора позволяет сократить продолжительность этого исследования.
Grubb [324], изучая конглютинационные свойства синтетического плазмоза-менителя - декстрана, показал, что титры сывороток антирезус при разведении их декстраном значительно превышают результаты титрования в изотоническом растворе натрия хлорида.
Продолжая начатые Grubb исследования, Jones [382] и Bonnel [178] установили, что декстран по сравнению с изогемагглютинирующими сыворотками и альбумином также обладает более выраженными конглютинационными свойствами.
И.И. Забалуева [54], изучив конглютинационные свойства декстрана, указала на возможность его применения в качестве стандартного разводителя, позволяющего увеличить ресурсы дефицитных сывороток антирезус. Кроме того, использование декстрана при определении резус-фактора значительно повысило демонстративность реакции (А.Я. Ашкенази [9], О.В. Успенская [123]).
Наряду с перечисленными коллоидами широкое применение в серологических реакциях нашел также другой синтетический плазмозаменитель - поливи-нилпирролидон, который не уступает по своим конглютинационным свойствам растворам декстрана (McNeil, Trentelman [474], Stroje и соавт. [637]).
Замена плазмы другими коллоидными разводителями позволила существенно улучшить качество конглютинационных методов, в частности повысить четкость результатов исследования, сократить его продолжительность.
Дальнейшее совершенствование конглютинационных проб способствовало созданию методов, пригодных для определения резус-фактора без нагревательных приборов. Интересные данные получили Eldon [273] и Drachmann [264], Они показали, что сыворотки антирезус, разведенные высокомолекулярным декстраном, приобретают способность специфически агглютинировать эритроциты в условиях комнатной температуры.
Вслед за этим были предложены методы определения резус-фактора без подогрева с использованием альбумина (Murray [499]; Hrubisko, Hrabinska [354]; Sturgeon [640]) и гепарина (А.Я. Ашкенази [13]; Daszynski [250]). Наибольший практический интерес представляет метод, разработанный Hrubisko и Hrabinska. При определении резус-фактора этим методом каплю тестовой сыворотки в комбинации с альбумином наносят на предметное стекло и добавляют 5-10% взвесь эритроцитов в собственной сыворотке. Стекло оставляют на 10 мин при комнатной температуре, после чего учитывают результат.
Таким образом, применение коллоидных растворов с более выраженным, чем у плазмы, конглютинационными свойствами позволило не только сократить продолжительность определения резус-фактора и повысить четкость результатов этого исследования, но и существенно упростить его.
Нами совместно с P.M. Уринсон и Е.А. Зотиковым [34, 49] был разработан экспресс-метод определения резус-фактора на плоскости без подогрева, основанный на использовании сывороток антирезус в комбинации с альбумином или полиглюкином. Этот метод позволил определять одновременно резус-фактор, его разновидности и группу крови. Благодаря своей простоте и доступности он широко применялся в лечебно-профилактических учреждениях России в период с 1966 г. до конца 1980-х гг., пока не уступил место еще более простым методам с использованием моноклональных антител.
Также перспективным в плане разработки более совершенных методов определения резус-фактора оказалось еще одно направление, а именно использование в серологических реакциях протеолитических ферментов.
Первые сообщения о принципе ускорения реакции антиген - антитело с помощью ферментов появилось в 1946-1947 гг. (Pickles [525], Morton, Pickles [490]). Вскоре после этого различными авторами был предложен целый ряд серологических методов выявления антигенов и антител с использованием протеолитических ферментов животного, растительного и бактериального происхождения: трипсина (Morton, Pickles [489], Willert [718], Young [727]), папаина (Lov [449], Gilbey [303]),
бромелина (Pirofsky и соавт. [528], Moore и соавт. [479], Majsky [456]), протелина (Р.С. Сахаров [95]), фицина (СИ. Донсков [36]) и других ферментов.
Разработка этих методов имела большое практическое значение, так как позволила повысить чувствительность реакции. Более того, с помощью ферментов некоторым авторам удалось создать методы определения резус-фактора, не требующие нагревательных приборов (Р.С. Сахаров [95], СИ. Донсков [36]).
При определении резус-фактора методом, разработанным Hekker с соавт. [344], тестовую сыворотку, папаин, активированный солянокислым цистеином, и взвесь исследуемых эритроцитов наносят на предметное стекло и выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре. После этого стекло покачивают и учитывают результат. Morganti [488] и Esche [274] дали высокую оценку этому методу, подчеркивая его быстроту и наглядность результатов. То же самое можно сказать о методе, предложенном Tribedi, Crosbie [662] и Р.С. Сахаровым [95].
Таким образом, была показана принципиальная возможность определения резус-фактора с помощью сывороток в сочетании с высокомолекулярными коллоидами или протеолитическими ферментами и созданы первые методы, такие же быстрые, удобные и простые как определение группы крови.
