Опубликовано: 19 апреля 2014

Eggington и соавт. [270] считают, что применение пулов эритроцитов снижает чувствительность метода, затрудняет интерпретацию результатов, уменьшает процент выявления антител. К такому же выводу пришли Bombail-Girard и соавт [177], Phillips                                                                                                                      

Возможность создания принципиально отличающейся системы, не связан­ной с прямым выявлением агглютинации эритроцитов, обсуждается в работе Narayanan и соавт. [503]. Авторы предложили новый способ учета реакции аг­глютинации в обычном и ультрафиолетовом свете. Эта система получила поло­жительную оценку Министерства здравоохранения США (Poole и соавт. [533]).

Метод дает возможность объективно оценить результаты непрямой реакции Кумбса, однако ряд технических особенностей не позволяет использовать его в конвейерной работе.

Предложены 6 приемов оценки иммуносерологических методов (Voak [679], Poole и соавт. [533]).

1. Тест на чувствительность, при котором применяют заведомо слабые анти­тела. Применение сильных антител сглаживает картину, так как они имеют вы­сокую авидность, поэтому их легко обнаруживают даже в больших разведениях.
2. Тест на юспроизводимость метода с использованием гетерозиготных образцов эритроцитов, сенсибилизированных слабыми референтным aHra-D-антителами IgG.
3. Титрование антител, относящихся к разным антигенным системам эритро­цитов: анти-К, анти-Ру^а, анти-Jk³ и др. - для установления уровня чувствитель­ности в отношении антигенов каждой системы.
4. Пробный подбор совместимых пар донор - реципиент с применением све­жих образцов сыворотки и эритроцитов. Такой подбор позволяет выявить лож-ноположительные результаты, обусловленные комплементом исследуемой сы­воротки и антикомплементарными антителами, в основном анти-СЗё, присут­ствующими в тестовых антиглобулиновых реагентах.
5. Сравнительные испытания (не менее 3000 тестов) в разных лечебных учреждениях. Такие испытания хорошо выявляют недостатки и слабости лю­бых тестовых систем, обладающих разной степенью чувствительности к тем или иным антигенам и антителам.
6. Тесты с гомо- и гетерозиготной формой различных антигенов для отобра методики, которая будет хорошо работать с гетерозиготными эритроцитами. Например, микроплатовые системы Solid Screen (Biotest) и Capture (Immuno) не требуют использования эритроцитов, гомозиготных по данным антигенам, и лучше выявляют слабые антитела, чем системы микрокапиллярных гелевых ко­лонок или классическая непрямая проба Кумбса (Poole и соавт. [533]).

Однако дальнейшие исследования показали, что примерно 50 % образцов эритроцитов Kk низкоавидны при выявлении антител Келл-Челлано. Это дает основание беспокоиться о качестве скрининга антител, так как невозможно обеспечить гомозиготными по антигену К эритроцитами все панели для скрининга антител из-за относительной редкости гомозигот КК: 2-3 образца на 1 тыс. (Phillips, Voak [521]).  щ

В литературе имеются сведения о создании иммуносерологических методов нового поколения, основанных на использовании антигенов эритроцитов, выде­ленных в чистом виде. Возможно, самая лучшая система, которая будет разра­ботана в ближайшем обозримом будущем, позволит проводить скрининг анти­тел с помощью биологического микрочипа, на который нанесены все известные трансфузионно опасные антигены. Над созданием подобных методов работает несколько групп ученых: одна - под руководством М. Scott в Международной референс-лаборатории групп крови (Бристоль, Англия), другая - под руковод-ством М. Read в Центре крови Нью-Йорка. Не исключено, что уже в ближай­шие годы мы можем стать свидетелями новых автоматизированных иммуно-ферментных методов определения клинически наиболее значимых эритроци-тарных антител без использования эритроцитов (Ekins [271], Ekins, Chu [272]). Попытки создания биочипов предпринимаются и в нашей стране.

Проанализированные нами данные литературы убеждают в том, что, несмо­тря на большой выбор автоматизированных методик, наилучшей до настоящего времени остается непрямая проба Кумбса.

По нашему мнению, упомянутое выше малогабаритное оборудова­ние Н.И. Васильева, специально предназначенное для проведения этой пробы, позволяет обеспечить высокое качество подбора совместимой крови для пере­ливания реципиенту.

Опубликовано: 19 апреля 2014

История инструментальных автоматизированных методов иммуносерологического исследования начинает свой отсчет с 1960-х годов.

В 1963 г. в США McNeil и соавт. [473] предложили для определения группы крови анализатор «Техникой», применявшийся для биохимических исследова­ний. В основу прибора положен принцип движущихся порций эритроцитов, от­деленных друг от друга воздушной перемычкой, по спирально извитым пласти­ковым трубкам, в которые подают тестовые стандартные сыворотки. Длина тру­бок и скорость проталкивания образцов были рассчитаны таким образом, чтобы тестовые сыворотки успевали прореагировать с антигенами исследуемых эри-троцитов. Результаты учитывали фотометрическим методом: измерением раз­ности светопоглощения реагирующей смеси до и после реакции.

Анализатор McNeil представлял собой одноканальный прибор, что не позво­ляло проводить несколько исследований параллельно.

Для повышения чувствительности анализатора Sturgeon и соавт. [641] предложили предварительную обработку эритроцитов протеолитическими ферментами растительного происхождения. Наиболее эффективным для этих целей оказался бромелин - фермент, выделяемый из млечного сока стеблей ананасов.                                                                                                                                                                                                                                                 

Далее Sturgeon и соавт. [643] применили многоканальные варианты прибо-ра, анализирующие образец крови одновременно по нескольким параметрам, что существенно расширило возможности анализатора и его пропускную спо­собность. Авторы сконструировали 8-канальный прибор, определяющий груп­пу крови АВО и резус.

Затем были сконструированы 10-15-канальные системы (Peoples и соавт. [518], Moore, Fernandes и соавт. [478]), что позволило автоматизировать не только определение антигенов эритроцитов АВО и резус, но и проводить реакции на сифилис (Shoeter и соавт. [610]) и австралийский антиген (Berkman и соавт. [166], Moore, Fernandes [478]).

Широкое применение нашел БМЦ-тест (бромелинметилцеллюлозный), который повысил чувствительность приборов при выявлении антител Rh-Hr, Lewis, Kell, Daffy.

Заметным прогрессом в развитии автоматизированных методов серологи­ческого исследования явилась предложенная Lalezari [407] методика с исполь­зованием полибрена, с помощью которой выявляли антигены и антитела си­стемы Daffy, Kell, Kidd, MNSs в тех случаях, когда ферментная техника оказы­валась неэффективной.

Протеолитические ферменты существенно активируют реакцию связывания ан­тигенов и антител системы резус, однако, по мнению некоторых авторов, разруша­ют антигены Kell, Daffy (Nevaulinna, Pircola [505], A.A. Рагимов, Н.Г. Дашкова [92]).

Habibi и соавт. [332] применили одновременно несколько ферментных те­стов: ПМЦ-тест (папаинметилцеллюлозный), ТМЦ-тест (трипсинметилцел-люлозный) и полибреновый тест, что дало возможность проводить скрининг антител различного характера с максимально широкой специфичностью, улав­ливать те разновидности антител, которые выявляют исключительно каким-либо одним методом.

Более того, была автоматизирована антиглобулиновая проба Кумбса (Valeri и соавт. [675]), что создало предпосылки для внедрения оборудования, предназна­ченного для повседневного автоматизированного скрининга антител различной специфичности (Cotton, Ray [239], Moore [477]), в том числе аутоантител, фик­сированных на эритроцитах (Gorska и соавт. [310]), а также послужило основой автоматизации пробы на индивидуальную совместимость донора и реципиента при переливании эритроцитов (Wattar и соавт. [699]).

Rowe и соавт. [586] предложили полностью автоматизированную многоканальную систему «Техникой М-16» с микропроцессорным оснащением для интерпретации результатов серологических реакций и ввели в систему сканирующее лазерное устройство, идентифицирующее исследуемые образцы крови по бар-коду. Впервые бар-код в анализаторах групп крови был применен во французских приборах «Групаматик».

Одновременно с созданием в США анализаторов групп крови «Техникой» во Франции с 1963 по 1969 год под руководством Matte [465] была разработа­на принципиально отличающаяся автоматизированная система «Групаматик» (Groupamatic-50, -250, -360 соответственно на 50,250,360 определений в 1ч).

В отличие от аппаратов «Техникой» в приборах «Групаматик» был применен ком­пьютер, что обеспечило автоматическую интерпретацию результатов и вывод их на печать. Наиболее производительный вариант прибора представлял собой 12-каналь-ную систему, рассчитанную на исследование 360 образцов крови в 1 ч (Soulier [621]).

Другое немаловажное отличие системы «Групаматик» от системы «Техникой» заключалось в способе учета результатов серологических реакций. Визуальный учет результатов в автомате был заменен оптическим способом ре­гистрации: фотометрией жидкой части смеси и осадка (Unger, Ramgren [672]).

В приборах «Групаматик» для повышения чувствительности реакции было применено центрифугирование реагирующей смеси с последующим ресуспен-дированием посредством встряхивания. Это важная деталь в проведении имму-носерологических реакций.

Весьма существенным также было то, что выдачу ошибочных результатов (не укладывающихся в закономерности групповой дифференцировки крови людей) прибор блокировал.

Последующее техническое усовершенствование автоматов «Групаматик» по­зволило увеличить объем исследований, выполняемых при апробации донор­ской крови, а именно: ввести исследование сыворотки крови доноров на си­филис, гепатит, а также идентифицировать дозы крови при их выдаче потреби­телю, что при обычном, не автоматизированном, выполнении этой процедуры было источником ошибок (Р.А. Авдеева, Л.П. Лаврова [5]).

В аппаратах «Групаматик» успешно применяются те же методы, что и в аппаратах «Техникой»: бромелинметилцеллюлозная техника (Garetta и соавт. [297]), трипсин-полибренцитратная техника (Confida и соавт. [235]), антигаобулиновый метод (Matte [466]), реакция конглютинации в коллоидных средах (Habibi и соавт. [333]). Базовой серологической методикой приборов «Групаматик» является бромелиновая техника, обеспечивающая оптимальное определение наиболее значимых факторов в клиниче­ской трансфузиологии - группы крови АВО и резус-принадлежности (Haahty [330], O.K. Гаврилов и др. [25], Р.А. Авдеева и др. [4,5], Л.П. Лаврова и др. [73,74]).

Приборы «Групаматик» нашли применение в США, Англии, Японии, Швеции, Австрии. По своим техническим характеристикам - пропускной спо­собности, чувствительности реакций, надежности получаемых результатов -они выгодно отличались от других автоматов (Soustelle и соавт. [623]).

Известны модификации приборов для определения групп крови: «мини-Групаматик» (Reviel, Emblin [562]) и варианты прибора «Техникой» (Severns и соавт. [603]), позволяющие выполнять реакцию в микроплатах, что существен­но сокращает расход реагентов (Descamps и соавт. [260]).

Обращает на себя внимание предложенный в 1986 г. метод агглютинации в геле [261], который представляет собой комбинацию двух методов: агглютина­ции и гель-фильтрации*.

Попытки создания автоматических анализаторов групп крови были предпри­няты и в нашей стране. В 1990 г. в Гематологическом научном центре Российский Академии медицинских наук совместно с научно-исследовательским и конструк­торским институтом медицинской лабораторной техники Минмедпрома СССР был разработан и успешно прошел лабораторные испытания первый отечествен­ный анализатор групп крови - АГК-01 (А.Н. Алипов и др. [7], Р.С. Каландаров [63]). Прибор представлял собой полуавтоматическую систему, в которой были автоматизированы отдельные этапы реакции: разведение пробы, перемешивание

Метод подробно описан в книге А.А. Рагимова и Н.Г. Дашковой: «Основы трансфузион-ной иммунологии» [91].

нгредиентов реакции (эритроцитов и сывороток), центрифугирование смеси, учет результатов реакции, вывод результатов на печать. Производительность при­бора - 48 образцов крови в час.

По нашему мнению, реакция агглютинации эритроцитов как специфический фе­номен - быстропротекающий процесс, имеющий сложные био-физико-химические составляющие. Этот взгляд нашел подтверждение в работах Р.С. Каландарова [63], а также других авторов (Wardlaw и соавт. [698], B.C. Андреев [8]).

Поиск новых физических принципов оценки реакции агтлютинации представляет чрезвычайный интерес для теории и практики иммуносерологических исследований.

В последние годы получены интересные данные о своеобразном действии ультразвука на взвесь корпускулярных частиц (Н.Н. Князьков [65]). Ультразвук нарушает суспензионную стабильность эритроцитов и приводит к их быстрому оседанию (СИ. Донсков и др. [43], Р.С. Каландаров и др. [63,64]).

В течение нескольких секунд после подачи ультразвука взвесь эритроцитов расслаивается, образуются видимые агрегаты эритроцитов, которые после от­ключения ультразвука начинают быстро оседать на дно пробирки. Как отмеча­ют Н.Н. Князьков [65] и Р.С. Каландаров [63], ультразвук может найти примене­ние в анализаторах серологических реакций нового поколения.

В последние годы Narayanan и соавт. [503] разработали новую технологию типирования крови, основанную на спектроскопии в видимой и ультрафиолето­вой части спектра. Группу крови определяют по изменению оптической плотно­сти взвеси эритроцитов в присутствии агглютинирующих антител. Оптическая плотность ниже 665 нм соответствует отрицательному результату, выше 1000 нм - положительному. С помощью этого метода удалось с достаточно вы­сокой степенью совпадения определять группу крови и резус-принадлежность.

Несмотря на очевидные успехи в развитии автоматизированных серологических методов исследования, возможности их совершенствования далеко не исчерпаны.

Идеология конструирования анализаторов серологических реакций пер­вого поколения (приборы «Техникой», «Групаматик», «Контифло») бази­ровалась на принципе полной автоматизации без участия оператора, что­бы исключить ошибки, связанные с так называемым человеческим факто­ром. Процесс определения, согласно этой идеологии, должен быть поточным (конвейерным) и по возможности универсальным, пригодным для определе­ния максимального спектра антигенов и антител, отличающихся своими се­рологическими и физико-химическими характеристиками. Такое оборудова­ние предназначалось для крупных банков крови, имеющих огромную произ­водительность. Однако за всем этим не усматривались потребности неболь­ших, но наиболее многочисленных, особенно для Российской Федерации, структуру- отделений и кабинетов переливания крови. Их в Российской Федерации насчитывается более 1000.

Специальное малогабаритное оборудование разработанное Н.И. Васильевым |24}, адаптировано для проведения пробы на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента в условиях отделения переливания крови, в непо­средственной близости от постели больного.

Опубликовано: 19 апреля 2014

Для производства моноклональных антител применяют метод гибридизации иммунных лимфоцитов (полученных от иммунизированных людей) с клетками мышиной миеломы или трансформации иммунных лимфоцитов вирусами. Вместо миеломных клеток мыши используют также лимфобластоидные клеточные линии человека. Гетеро- и аллогибридомы обладают способностью к самоподдержанию, присущей опухолевым клеткам, и одновременно способностью продуцировать ан­титела. Существует несколько способов гибридизации иммунных лимфоцитов:

• прямая гибридизация, когда лимфоциты иммунизированного лица сли­вают с клетками миеломы в расчете, что среди слившихся клеток мо­гут оказаться лимфобласты, продуцирующие моноклональные антите­ла. Этот способ менее эффективен, поскольку вероятность слияния опу­холевых и антителопродуцирующих клеток очень мала;
• реиммунизация in vitro, когда перед слиянием с миеломными клетками им­мунные лимфоциты выдерживают с эритроцитами, содержащими соответ­ствующий антиген, то есть иммунизируют их вторично. Этот прием позво­ляет повысить концентрацию лимфобластов или лимфобластоподобных клеток во взвеси иммунных лимфоцитов и таким образом увеличить веро­ятность получения требуемого гибрвда-продуцента;
• трансформация иммунных лимфоцитов вирусом Эпштейна - Барр. Этот способ не требует использования мышиной миеломы. Эффект превраще­ния короткоживущих иммунных лимфоцитов в самоподдерживающуюся линию достигается тем, что встроившийся в геном клетки вирус придает ей способность к безудержной пролиферации.

Вирусную трансформацию лимфоцитов, придающую им опухолегенные, ма-лигнизирующие свойства, можно рассматривать как своеобразную гибридиза­цию ДНК лимфоцитов и ДНК вирусов. В результате такой гибридизации лим­фоциты или лимфобластоподобные клетки преодолевают апоптоз (управляе­мую гибель клеток) и становятся практически бессмертными#

Первые моноклональные анти-О-антитела были получены Вгоп и соавт. [184], Lowe и соавт. [450], Thompson и соавт. [652] и другими авторами [291,
402, 555]. Вскоре были получены антитела анти-С [651], анти-с [555, 651], анти-Е [651], анти-е [182, 292, 651], анти-G [290, 651], aHTH-C^w [653], анти- Rhl7, анти-Ю129 и анти-Ю146 [580,659].

Первые в России моноклональные антитела анти-D и анти-DC полу­чены в Центральном НИИ гематологии и переливания крови профессо­ром И.Л. Чертковым с сотрудниками [17,18, 31].

И.В. Дубинкиным с соавт. получены штаммы гетерогибридом человек х мышь, продуцирующие моноклональные антитела к антигенам D, с, C^w, Е и др., пригод­ные для промышленного производства диагностических реагентов [51,52,53].

Для этого лимфоциты периферической крови доноров, продуцирующих соответ­ствующие антитела, гибридизировали с клетками мышиной миеломы Х-63 и NS1.

Полученные антитела тестировали по панели стандартных эритроцитов ГНЦ РАМН (табл. 4.40). Класс иммуноглобулинов устанавливали с помощью мы­шиных моноклональных антител к иммуноглобулинам человека в реакции не­прямой иммунофлюоресценции. Титр антител определяли посредством реак­ции в солевой и коллоидной среде, а также непрямой реакции Кумбса в зависи­мости от принадлежности антител к тому или иному классу иммуноглобулинов (табл. 4.41).

Таблица 4.40

Протокол испытания моноклональных антител со стандартными эритроцитами

Оптимальным разводителем моноклональных антител анти-Rh, позво­лившим получать активные и специфичные тестовые реагенты, явились рас­творы с низкой ионной силой в комбинации с коллоидами полисахаридной природы. В настоящее время эти реагенты широко применяют в лечебно-профилактических учреждениях.

Характеристика моноклональных антител

Опубликовано: 19 апреля 2014

Landsteiner и Wiener [408] и усовершенствован Boorman, Dodd и Mollison [179]. В СССР метод агглютинации в солевой среде был внедрен в Центральном ин­ституте переливания крови М.А. Умновой [113] и его применяют до настояще­го времени.

Метод отличается точностью и четкостью результатов, однако при его вы­полнении необходимо отмывать исследуемые эритроциты, готовить из них взвеси и длительно (1ч) инкубировать взвеси с сывороткой. Перечисленные ма­нипуляции требуют специального оснащения: термостата, центрифуги, микро­пробирок, что усложняет исследование и увеличивает его продолжительность.

В связи с этим усилия многих исследователей были направлены на упроще­ние этого метода. Однако многочисленные модификации метода солевой агглю­тинации, в частности капиллярные методики (Chown [215], Chown, Lewis [217, 220]), пробы с применением центрифугирования (Poole, Williams [534], Harvey [337], Majsky [455]) или выполняемые на плоскости (Wootton [723]), были по существу сведены к упрощению отдельных технических элементов. В целом же определение резус-фактора этим методом продолжает оставаться до настояще­го времени относительно сложным и продолжительным лабораторным исследо­ванием. К этому следует добавить и то обстоятельство, что сыворотки с полны­ми антителами, необходимые для метода агглютинации в солевой среде, редко встречаются и их количество ограничено. Однако с внедрением технологий по­лучения моноклональных антител это ограничение было снято.

Более перспективными оказались методы, включающие использование сы­вороток с неполными антителами. Благодаря относительной простоте и доступ­ности тестовых сывороток они нашли широкое применение как за рубежом, так и в России.

Наибольший практический интерес из этой группы методов представляют конглютинационные пробы, основанные на использовании различных коллоид­ных жидкостей, которые либо добавляют к тестовой сыворотке, либо взвешива­ют в них исследуемые эритроциты.

Первая конглютинационная проба с применением в качестве коллоидной среды плазмы крови была предложена Diamond и Abelson [262].

В СССР аналогичный метод был разработан независимо от указанных выше авторов в Ленинградском институте переливания крови Н.И. Блиновым и Н.Д. Дробышевой [21] и впоследствии усовершенствован Т.Г. Соловьевой [104]. Этот метод, получивший название - определение резус-фактора в сывороточ­ной среде на чашках Петри, основан на использовании эритроцитов, взвешен­ных в собственной сыворотке. Взвесь эритроцитов и тестовых сывороток нано­сят на чашку Петри, которую затем помещают в водяную баню при температу­ре 45-48 °С. Результат учитывают после 10-минутной инкубации взвеси по на­личию или отсутствию агглютинации эритроцитов. «Чашечный» метод прост и удобен, однако его недостатком является невозможность исследования свежей цельной крови, так как в условиях указанной температуры она свертывается.

я устранения этого недостатка E.G. Копосов [67, 68] рекомендовал ис­пользовать смесь свежей цельной крови с одногруппной стандартной изогемаг-глютинирующей сывороткой.

А.Я. Ашкенази [13] предложила другой, более удачный, прием устранения отмеченного недостатка «чашечного» метода. Автор рекомендовала добавлять в тестовую сыворотку гепарин, что позволило определять резус-фактор свежей крови, взятой непосредственно от обследуемого. Тем не менее «чашечный» ме­тод, так же как и другие конглютинационные пробы, основанные на использо­вании плазмы или сыворотки, нуждался в существенной доработке. Дело в том, что плазма и сыворотка, в которой взвешивают исследуемые эритроциты, об­ладают относительно низкой конглютинационной активностью, в силу чего аг­глютинация эритроцитов в большинстве случаев выражена недостаточно силь­но. Поиски коллоидных сред с более выраженными конглютинационными свой­ствами привели исследователей к использованию других естественных и синте­тических коллоидов.

Diamond и Denton [263] впервые отметили, что агглютинация эритроцитов выражена в значительно большой степени, если плазму, в которой они были взвешены, заменить раствором альбумина. Позднее эти данные были подтверждены, и альбумин стал широко применяться при определении резус-фактора (Р.М. Уринсон [118], Tuck [663], Stratton [633], Lawrence [414]).                                                                                                                                                                                                                                                     

Fisk и Мс Gee [286] обратили внимание на высокие конглютинационные свойства раствора желатина и предложили использовать его в качестве кол­лоидной среды при определении резус-фактора и выявлении неполных резус-антител. Впоследствии этот метод был модифицирован А.Г. Башлай [15] и до настоящего времени с успехом применяется во многих серологических лабора­ториях Российской Федерации.

О.В. Успенская [123] привела данные, свидетельствующие о том, что приме­нение раствора желатины при определении резус-фактора позволяет сократить продолжительность этого исследования.

Grubb [324], изучая конглютинационные свойства синтетического плазмоза-менителя - декстрана, показал, что титры сывороток антирезус при разведении их декстраном значительно превышают результаты титрования в изотоническом растворе натрия хлорида.

Продолжая начатые Grubb исследования, Jones [382] и Bonnel [178] устано­вили, что декстран по сравнению с изогемагглютинирующими сыворотками и альбумином также обладает более выраженными конглютинационными свой­ствами.

И.И. Забалуева [54], изучив конглютинационные свойства декстрана, указа­ла на возможность его применения в качестве стандартного разводителя, позво­ляющего увеличить ресурсы дефицитных сывороток антирезус. Кроме того, ис­пользование декстрана при определении резус-фактора значительно повысило демонстративность реакции (А.Я. Ашкенази [9], О.В. Успенская [123]).

Наряду с перечисленными коллоидами широкое применение в серологиче­ских реакциях нашел также другой синтетический плазмозаменитель - поливи-нилпирролидон, который не уступает по своим конглютинационным свойствам растворам декстрана (McNeil, Trentelman [474], Stroje и соавт. [637]).

Замена плазмы другими коллоидными разводителями позволила существен­но улучшить качество конглютинационных методов, в частности повысить чет­кость результатов исследования, сократить его продолжительность.

Дальнейшее совершенствование конглютинационных проб способствовало созданию методов, пригодных для определения резус-фактора без нагреватель­ных приборов. Интересные данные получили Eldon [273] и Drachmann [264], Они показали, что сыворотки антирезус, разведенные высокомолекулярным декстраном, приобретают способность специфически агглютинировать эритро­циты в условиях комнатной температуры.

Вслед за этим были предложены методы определения резус-фактора без подогрева с использованием альбумина (Murray [499]; Hrubisko, Hrabinska [354]; Sturgeon [640]) и гепарина (А.Я. Ашкенази [13]; Daszynski [250]). Наи­больший практический интерес представляет метод, разработанный Hrubisko и Hrabinska. При определении резус-фактора этим методом каплю тестовой сы­воротки в комбинации с альбумином наносят на предметное стекло и добавля­ют 5-10% взвесь эритроцитов в собственной сыворотке. Стекло оставляют на 10 мин при комнатной температуре, после чего учитывают результат.

Таким образом, применение коллоидных растворов с более выраженным, чем у плазмы, конглютинационными свойствами позволило не только сократить продолжительность определения резус-фактора и повысить четкость результа­тов этого исследования, но и существенно упростить его.

Нами совместно с P.M. Уринсон и Е.А. Зотиковым [34, 49] был разработан экспресс-метод определения резус-фактора на плоскости без подогрева, осно­ванный на использовании сывороток антирезус в комбинации с альбумином или полиглюкином. Этот метод позволил определять одновременно резус-фактор, его разновидности и группу крови. Благодаря своей простоте и доступности он широко применялся в лечебно-профилактических учреждениях России в пери­од с 1966 г. до конца 1980-х гг., пока не уступил место еще более простым мето­дам с использованием моноклональных антител.

Также перспективным в плане разработки более совершенных методов опре­деления резус-фактора оказалось еще одно направление, а именно использова­ние в серологических реакциях протеолитических ферментов.

Первые сообщения о принципе ускорения реакции антиген - антитело с помо­щью ферментов появилось в 1946-1947 гг. (Pickles [525], Morton, Pickles [490]). Вскоре после этого различными авторами был предложен целый ряд серологиче­ских методов выявления антигенов и антител с использованием протеолитических ферментов животного, растительного и бактериального происхождения: трипсина (Morton, Pickles [489], Willert [718], Young [727]), папаина (Lov [449], Gilbey [303]),

бромелина (Pirofsky и соавт. [528], Moore и соавт. [479], Majsky [456]), протелина (Р.С. Сахаров [95]), фицина (СИ. Донсков [36]) и других ферментов.

Разработка этих методов имела большое практическое значение, так как по­зволила повысить чувствительность реакции. Более того, с помощью фермен­тов некоторым авторам удалось создать методы определения резус-фактора, не требующие нагревательных приборов (Р.С. Сахаров [95], СИ. Донсков [36]).

При определении резус-фактора методом, разработанным Hekker с соавт. [344], тестовую сыворотку, папаин, активированный солянокислым цистеином, и взвесь исследуемых эритроцитов наносят на предметное стекло и выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре. После этого стекло покачивают и учитывают результат. Morganti [488] и Esche [274] дали высокую оценку этому методу, подчеркивая его быстроту и наглядность результатов. То же самое можно сказать о методе, предложенном Tribedi, Crosbie [662] и Р.С. Сахаровым [95].

Таким образом, была показана принципиальная возможность определения резус-фактора с помощью сывороток в сочетании с высокомолекулярными кол­лоидами или протеолитическими ферментами и созданы первые методы, такие же быстрые, удобные и простые как определение группы крови.