Система RH

Moore и Green [481] обнаружили, что в процессе иммунной преципита­ции полипептидов D и сЕ специфическими антителами одновременно с по­липептидами преципитируются N-гликозилированные белки, получившие на­звание RhAG (Rh-ассоциированные гликопротеины), или Rh-гликопротеины. Компоненты этих белков, сопровождающие полипептиды D и еС, имели не­сколько отличающуюся мол. массу, но одинаковую N-концевую аминокислот­ную последовательность [147].

Ridgwell и соавт. [565] клонировали фрагменты кДНК, соответствующие

Rh-связанному гликопротеину, и выделили кДНК полной длины из библио­теки кДНК костного мозга человека. Полученный Rh-гликопротеин содер­жал 409 аминокислот и имел, подобно полипептидам Rh, 12 мембранных до­менов с внутриклеточными N- и С-концевыми участками. Аминокислотная последовательность Rh-гликопротеина и Rh-полипептида различалась. Сходство ограничивалось двумя аминокислотными остатками в первом и пя­том домене: Glu 13 и Glu 146 - в гликопротеине Rh, Glu 21 и Glu 146 - в по­липептиде Rh [565].

Структура генов RH

В 1972 г. Ruddle и соавт. [587] удалось определить, что генный локус систе­мы резус расположен на хромосоме 1. Затем он был картирован на коротком плече хромосомы в участке 1р34.3-р36.13 [211,453,462].

Когда была получена кДНК, соответствующая Rh-полипептидам, ее можно было использовать в качестве зонда в Саузерн-блоте для исследования геном­ной ДНК, т. е. определения структуры генов RH.

Результаты этих исследований подтвердили, что локус RH включает 2 очень похожих гена (СЕ и £>), а один из этих генов отсутствует в гДНК, выделенной у нескольких неродственных лиц D- [233]. Таким образом была установлена мо­лекулярная основа общего для европеоидов фенотипа Rh-, который часто обу­словлен делецией гена D.

Ген D включает 10 экзонов и имеет организацию, похожую на структуру гена СЕ, но не идентичную ей (см. рис. 4.7).

Гены D и СЕ различаются по интрону 4 [138]. В гене СЕ имеется деле­ция 650 пар нуклеотидов, начинающаяся в интроне 4 от нуклеотида 181 [146]. Интрон 4 гена СЕ имеет 1976 пар нуклеотидов. Нуклеотиды в положении 1-181 и 831-1076 примерно идентичны в генах D и СЕ. Интрон 5 генов DnCE вклю­чает 1636 пар нуклеотидов. Имеется 29 нуклеотидных различий между этими двумя генами (98,2 % гомологии).

Организация гена СЕ исследована Cherif-Zahar и соавт. [209]. В связи с тем что антиген D обусловлен геном, отсутствующим у людей Rh-, определение молекулярной структуры антигенов Сс и Ее упростилось.

Mouro и соавт. [496] экстрагировали матричную РНК людей с редким фе­нотипом СсЕе и использовали синтетические олигонуклеотидные праймеры в присутствии обратной транскриптазы для получения кДНК полной длины, со­ответствующей продукту гена СЕ.

Присутствие антигенов Е и е было обусловлено заменой пролина на аланин в позиции 226. Пролин в этой позиции придавал субстрату специфичность Е, аланин - специфичность е (см. рис. 4.5).

При сравнении кДНК лиц, содержащих антигены С и с, ситуация ока-лась сложнее. Наблюдали 6 различий в нуклеотидах, одна часть из кото­рых (Cysffl6, He 60, Ser 68, Sep 103) коррелировала с экспрессией С, другая (Тгр 16, Leu 60, Asn 68, Pro 103) - с экспрессией с (hr¹) [496]. Эта находка была подтверждена амплификацией гДНК от людей с известным фенотипом: экзон 1 и 2 кодировал остатки, специфичные для антигенов Сс, а экзон 5 | специфичные для антигенов Ее.

Cherif-Zahar и соавт. [208] высказали предположение, что, хотя антигены Сс и Ее являются продуктами одного и того же гена и кодированы одним видом мРНК, возможен альтернативный сплайсинг, формирующий несколько белков. Полипептид полной длины кодирует экспрессию антигенов Ее, а не Сс; сплай-сеоформа, в которой отсутствует экзон 5, кодирует экспрессию Сс, но не Ее. Гипотеза подтверждается тем фактом, что из препаратов мРНК людей Rh- мо­гут быть выделены разные продукты гена СЕ.

По мнению Umenishi и соавт. [666], сплайсеоформы не являются произво­дными гена СЕ\ они могут также происходить от гена D. Некоторые сплайсео­формы выделены из незрелых эритробластов.

В экспериментах Smythe и соавт. [618] антигены с и Е были получены de novo на поверхности эритроидных клеток К562, в которые был введен ретро-вирус, комбинированный с кДНК, соответствующей сЕ-экспрессии. Поскольку использованная кДНК была полной длины, это отчетливо подтвердило, что ан­тигены с и Е находятся на одном и том же полипептиде.

Аминокислотная замена, определяющая Е- и е-специфичность [Pro 226 (ан­тиген Е), Ala 226 (антиген е)], находится в четвертой внеклеточной петле по­липептида СЕ. Эта локализация полностью соответствует серологическим раз­личиям антигенов Е и е. Однако антигенные различия обусловлены не толь­ко аминокислотной заменой, но и соответствующим молекулярным окружени­ем. Полипептид D также имеет остаток аланина в положении 226, но не несет е-антигенности.

Структура антигенов С и с сложнее, потому что полипептиды СЕ имеют 4 аминокислоты для антигена С и 4 - для антигена с, одна из которых [Ser 103 (антиген С) или Pro 103 (антиген с)] расположена на второй внеклеточной пет­ле полипептида.

Три из четырех аминокислот (Не 60, Ser 68, Ser 103), которые отличают С-активный полипептид от с-активного, обнаружены также в D-полипептиде. Этщ 3 аминокислоты кодируются экзоном 2 гена СЕ и экзоном 2 гена D. Не исключено, что именно благодаря этому подобию антигенов D и С антитела анти-D могут содержать анти-С-специфичность даже в тех случаях, когда эри­троциты, послужившие антигенным стимулом, не имели серологически выяв­ляемого антигена С, т. е. это был «чистый D». Во многом идентичная топология полипецтидов, кодируемых генами D и СЕ, лежит в основе перекрестных реак­ций антигенов и антител системы резус.

Считается, что гены RH синтезируют полипептиды, несущие Rh-антигены, не используя субстанций-предшественников.

В 1990-х годах 2 лаборатории независимо друг от друга получили совершен­но одинаковые клоны кДНК полипептидов RhcE (Cherif-Zahar и соавт. [208], Avent и соавт. [148]).

Выделение кДНК, соответствующей полипептиду D, было осуществлено не­зависимо 3 исследовательскими группами (Le Van Kim и соавт. [418], Агсе и со­авт. [138], Kajii и соавт. [390]). Последовательность аминокислот в белках, по­лученных при помощи кДНК RhD, отличалась от аминокислотной последова­тельности полипептида RhcE по 34-36 аминокислотным остаткам из 417 после­довательностей (рис. 4.7).

Аминокислотная последовательность транскриптов гена D и сЕ по Mouro и соавт. [496] и Schenkel-Brunner [597]. Пунктир означает одинаковую аминокислотную последовательность сравниваемых полипептидов.

Полипептиды D и сЕ имеют высокую степень гомологии: клон полипепти­да D, выделенный Агсе и соавт. [138], был на 96 % идентичен клону полипепти­да сЕ по последовательности нуклеотидов кДНК и на 92 % идентичен по струк­туре белка.

Le Van Kim и соавт. [418] показали, что полученные ими клоны кДНК явля­ются продуктом гена Д поскольку фрагменты геномной ДНК, с которыми со­впадали эти клоны, были получены от людей с фенотипом D+.

В то же время Kajii и соавт. [390] установили, что полученные ими клоны не были продуктом гена Д поскольку кДНК была идентифицирована у человека с фенотипом D-C+c+E+e+.                                                                                                                                                                                                                                   

Данные о том, что у некоторых людей фенотип D- обусловлен делецией гена Д были получены Colin и соавт. [233] в экспериментах с использованием мето­да Саузерн-блот.

Эксперименты с использованием трансфекции фрагментов ДНК [196, 496, 618] показали, что детерминанты С/с и Е/е расположены на одном полипептид­ном продукте, a D - на другом. Дополнительные доказательства того, что анти­гены Сс и Ее могут находиться на одном и том же полипептиде, получены Avent и соавт. [145] в исследованиях с сыворотками анти-С, анти-с, анти-Е и анти-е, которые, как выяснилось, реагируют с разными участками одного и того же по­липептида Rh.

Антигенные детерминанты Rh кодируются двумя похожими по структу­ре генами (Colin и соавт. [233], Агсе и соавт. [138]). Один из них (RHD) опре­деляет наличие трансмембранного белка, придающего эритроцитам D-актив-ность. У лиц Rh+ этот ген представлен одной или двумя копиями. Как уже упо­миналось, у большинства лиц Rh- ген, кодирующий субстрат D, отсутствует. Находящийся в прилежащем локусе ген RHCE определяет экспрессию антиге­нов С, с, Ей е.

Гены RH в каждом гаплотипе с большой точностью контролируют количе­ство вырабатываемого антигенного вещества. У разных членов одной и той же семьи гаплотип RH кодировал продукцию одинакового количества каждого при­сутствующего в фенотипе антигена (Rosenfield, Kochwa [393, 576]).

Принцип идентификации генов, ответственных за продукцию Rh-антигенов, сводится к следующему:

1. выделение несущего Rh-активность белка с помощью преципитации спец­ифическими антителами;
2. расшифровка аминокислотной последовательности иммунодоминантного белка, приготовление комплементарных молекулярных зондов и конструкций для идентификации кодирующей ДНК (кДНК);
3. вживление (трансфекция) кДНК в клетки или плазмиды, не производящие аналогичного иммунодоминантного продукта;
4. идентификация геномного продукта трансфектных клеток или плазмид;
5. идентификация геномной ДНК (гДНК), представляющей собой собственно ген с кодовой записью иммунодоминантного продукта.

Антигенные детерминанты Rh расположены на негликозилированных не-фосфорилированных полипептидах с мол. массой 30-32 кДа [129, 295, 483]. Полипептиды RhD и RhcE представляют собой цепь из 12 связанных со скелетом • мембраны доменов [348], пересекающих мембрану эритроцита от эндо- до экзо-целлюлярного уровня (рис. 4.5 и 4.6). Основная часть полипептида размещена в фосфолипидном бислое. На внешней стороне клетки домены соединены 6 высту­пающими над поверхностью мембраны петлями, на которых также могут распо­лагаться серологически выявляемые Rh-антигены. N- и С-концевые участки по­липептида погружены внутрь клетки [196]. Полипептид RhD, полученный искус­ственно в трансфектных клетках с помощью олигонуклеотидньгх праймеров и со­ответствующих кДНК людей Rh+, состоит из 417 аминокислот [147,172,590]. Из такого же числа аминокислот состоит полипептид RhcE, полученный таким же способом с использованием кДНК людей Rh- [138,390,418].

Топология мембранных доменов Rh-Hr no Schenkel-Brunner

Полипептид сЕ имеет 6 цистеиновых остатков, 5 из которых расположены в ци-топлазматических петлях. Шестой цистеин (Цис-285) находится в 5-й внеклеточной петле [564]. Цистеин в позиции 311 полипептида RhcE замещен на тирозин в поли­пептиде RhD. Отдельные последовательности (мотивы), например Cys - His - Leu -Не - Pro в положении 285-289, являются общими для всех эпитопов: D, Сс и Ее.

Высокая степень гомологии между генами RHDи RHCEспособствует ген­ной конверсии, неравновесному кроссинговеру и образованию в результате это­го гибридных генов, кодирующих продукцию новых антигенов Rh [597].

Rh-протеины высокогидрофобны и весьма прочно соединены с други­ми гидрофобными белками мембраны [336]. Обнаружена определенная связь Rh-полипептидов с гликофорином В, антигенами LW, гликопротеином, несу­щим антигены Duffy, гликопротеином CD47 и так называемым Rh-ассоцииро-ванным гликопротеином.

Rh-антигены устойчивы к воздействию протеолитических ферментов [295]. Антигены D и с (hr') разрушаются под воздействием N-этилмалеинимида, хлор-меркурибензоната и 2-нитробензойной кислоты. Это послужило для исследо­вателей основанием полагать, что Rh-субстанция содержит тиоловые группы [316,319,600,646].

Предполагаемая трехмерная структура доменов Rh-полипептида и Rh-ассоциированного гликопротеина в мембране эритроцита (по Avent [141]). Светлые и тем­ные цилиндры представляют домены Rh-полипептидов D и СЕ с N- и С-терминальными группами. На заднем плане условно представлен Rh-ассоциированный гликопротеин. Указаны участки разрывов при действии трипсина, папаина или бромелина, место рас­положения эпитопов D3, D4 и D9, экзо- и эндоцеллюлярные петли Rh-полипептида.

Йодацетамид не инактивировал D-антиген - это согласовывалось с предпо­ложением Dahr и соавт. о том, что цистеиновые остатки являются непосред­ственной составной частью D-антигена. Авторы пришли к выводу, что цистеи-новая модификация Rh-протеина, в частности Cys 285 в 5-й внеклеточной пет­ле, приводит к модификации антигена Rh.

Серологическая активность Rh-антигенов, как показал Green [317, 318], во многом зависела от содержания липидов в мембране эритроцитов. После вытяж­ки липидов из стромы п-бутанолом Rh-активность утрачивалась, а после инкуба­ции стромы с липидным экстрактом она полностью восстанавливалась. Как ука­зывает Schenkel-Brunner [597], липиды необходимы для оптимальной простран­ственной ориентации других структурных молекул в мембране эритроцита.

Обработка эритроцитов фосфолипазой, расщепляющей жирные кислоты, лектином, фосфатидилэтаноламином или фосфатидилсерином выраженно ин-гибировала активность антигенов с, D и е [320, 3366, 530].

На серологическую активность Rh-антигенов влияло обезвоживание мем­браны эритроцитов [154, 181, 609]. Высокий уровень холестерола (соотноше­ние холестерола и фосфолипидов 1,55) совпадал с повышенной вязкостью мем­браны и большей выраженностью D-антигена. Низкий уровень холестерола (со­отношение холестерола и фосфолипидов 0,55) сопровождался меньшей вязко­стью мембраны и менее активным реагированием D-антигена [597].

Отсутствие Rh-полипептидов у людей с фенотипом Rh_nul) сопряжено с изме­нениями в структурной организации липидного слоя мембраны и нарушением водно-ионного транспорта в клетке.

Из ранних работ (до 1960 г.) известно, что резус-антиген термолабилен и слабеет при высушивании (П.Н. Косяков [69]). Сыворотки антирезус снижа­ли свою активность при смешивании со стрептомицином, дериватами рибону­клеиновой кислоты, некоторыми сахарами и другими химическими вещества­ми, из чего авторы делали предположения о возможной химической природе резус-антигена.

Наличие в эритроцитах Rh+ Rh-ассоциированного гликопротеина, по-видимому, вводило в заблуждение исследователей, полагавших, что антигены резус имеют полисахаридную природу.