Система RH

Okubo и соавт. в 1984 г. [511] обнаружили, что эритроциты некоторых япон­ских доноров не агглютинировались поликлональными сыворотками анти-D и моноклональными антителами анти-D в антиглобулиновом тесте, однако ад­сорбировали на себе некоторое количество анти-О-антител. Антитела выявля­ли в элюатах, снятых с этих эритроцитов после адсорбции сывороток. Фенотип получил обозначение D_el (elution). Вскоре обратили внимание на то, что фено­тип D_el не встречался у лиц, имеющих анти-О-антитела. Среди 172 222 доноров Гонконга (китайцев) 99,71 % были D+. Из остальных 0,29 % лиц, которые по результатам серологического исследования типировались как одна треть, т. е. 0,09 % от всей популяции, имела фенотип D . Таким образом, почти каждый тысячный китаец является носителем D _г

У некоторых людей с эритроцитами D_el выявляли гаплотип Cde [339, 511], на основании чего Hasekura и соавт. [339] предположили, что фенотип D_el - это продукт гена Z)^w, супрессированного локусом С в положении транс.

Молекулярно-биологический анализ RHD-тена. у лиц D _р проведенный Chang и соавт. [205], выявил делецию 1013 пар нуклеотидов между нитронами 8 и 9 и выпадение почти всего экзона 9.

Fukumori и соавт. [294] считают, что японцы с фенотипом D_e] имеют нор­мальный ген Д но его полипептидный продукт на мембране эритроцитов, по неизвестным пока причинам, экспрессирован на очень низком уровне. Авторы исследовали 306 японских доноров, чьи эритроциты типировали как D-. Из них 102 имели эритроциты, адсорбировавшие анти-Б-антитела и высвобож­давшие их в элюат, т. е. доноры были D_el. У всех 102 доноров с помощью ПЦР найдены экзоны 4, 7 и 10 гена D. У остальных 204 доноров, не имевших фе­нотипа D_d, экзоны гена D отсутствовали. Похожую ситуацию наблюдали у не­гров. Анализ ДНК у негров часто подтверждал присутствие фрагментов гена D у лиц D-.

Chen и соавт. [207] исследовали ДНК 294 тайваньцев D- с помощью ПЦР. Из указанного количества 185 человек (62,9%) имели полную делецию гена RHD, 15 человек (5,1 %) - парциальный ген RHD, а 94 человека (32,0 %) отно­сились к категории D_el. У всех 94 человек с фенотипом D_el обнаруживали ну-клеотидную последовательность, характерную для экзона 9 гена RHD, и аллель 1227А. Авторы считают, что 2 указанные особенности молекулярного строения гена RHD являются генетическими маркерами фенотипа D_eI.

В немонголоидных популяциях фенотип D_el пока не описан.

Р.С. Сахаров и соавт. [97] обрабатывали высохшие пятна крови резус-по­ложительных и резус-отрицательных лиц (жителей г. Москвы) анти-Б-анти­телами и затем сравнивали полученные элюаты. Оказалось, что высохшая кровь резус-отрицательных лиц адсорбирует резус-антитела так же как и

резус-положительных. Элюаты с резус-отрицательной и резус-положительной крови имели практически одинаковую активность. Авторы полагают, что резус-антиген присутствует не только у лиц Rh+, но и в небольшом количе­стве у лиц Rh-. По их мнению, у резус-отрицательных людей эпитопы D рас­полагаются в эритроцитах не экстрацеллюлярно, как у резус-положительных, а эндоцеллюлярно. Поскольку работа указанными авторами не завершена, вряд ли можно сделать заключение, что москвичи Rh- имеют фенотип D_eI, хотя и нельзя исключить, что какая-то часть людей в русской популяции явля­ется носителем этого редкого фенотипа. Остается пока неизученным, насколь­ко экспрессированы Rh-антигены на внутриклеточной стороне мембраны эри­троцитов.

Фенотип D^u описан Stratton в 1946 г. [631] как новый вариант антигена си­стемы резус, слабо реагирующий с сыворотками анти-D. Частота D^u у ев­ропеоидов около 0,1 %. Находку подтвердили многие авторы [202, 218, 266, 329, 339, 429, 561]. Вскоре выяснилось, что различия между антигеном D и D^u имеют количественный, а не качественный характер [548, 578, 635]. Эритроциты D^u адсорбировали анти-О-антитела в меньшей степени, чем обыч­ные эритроциты D+, однако снятый с них элюат не проявлял какой-либо особой анти-О^и-специфичности.

Эритроциты D^u не реагируют в реакции солевой агглютинации с полными IgM анти-О-антителами, но реагируют с неполными IgG анти-О-антителами в коллоидных тестах, непрямой антиглобулиновой пробе. В ферментных методах они реагируют слабее (Stratton [632]). В отдельных случаях, при очень слабой вы­раженности антигена D^u, его выявляют только непрямой антиглобулиновой про­бой. Третьим элементом, отличающим фенотип D^u от D, является присутствие в этих эритроцитах примерно в 98 % случаев сильновыраженного антигена С.

Первоначальное обозначение D^u, данное Stratton, в настоящее время за­менено общим понятием «слабый D-антиген», или «слабый D-фенотип». Современные моноклональные реагенты анти-D агглютинируют большинство образцов крови, которые раньше при использовании поликлональных сыворо­ток были бы отнесены к слабому D-типу.

Эксперименты с поли- и моноклональными анти-О-антителами показали, что эритроциты D+ лиц CDe/cde и cDE/cDE несут соответственно около 10 тыс. и 30 тыс. участков антигена D на 1 эритроцит [364, 568]. На эритроцитах лиц Cde/cD^ue со слабым D-антигеном число антигенных участков снижено до 300 [648].

Beckers и соавт. [159] исследовали 6 человек со слабым D-антигеном и уста­новили, что число участков антигена D у них составило от 500 до 1000 на одну клетку; 4 обследованных имели фенотип D+C+c+E-e+, 2 - D+C-c+E+e+, т. е. не содержали антигена С. Все 6 человек имели ген RHD, который был абсолют­ен нормальным при исследовании в Саузерн-блоте и ПЦР. Авторы не приш­ли к какому-либо определенному выводу относительно механизма низкой (антигена D на эритроцитах исследованных людей. ВозможнЛэто связано с неэффективной транскрипцией или трансляцией участков нормально­го гена или другими механизмами, обусловливающими подавление продукции антигена.

По данным разных авторов, в среднем число антигенных участков на эритро­цитах со слабым D, снижено до 5-10 % от нормального уровня [157,187,648]. рНВ литературе обсуждаются 3 возможных механизма появления слабого фено­типа D.

Первый механизм обусловлен позицией транс генов С и D. В 1952 г. появи­лось сообщение Ceppellini и соавт. [204] о том, что у некоторых людей гаплотип Cde снижает продуктивность гена Д расположенного на другой хромосоме, т. е. находящегося по отношению к гену С в позиции транс. Слабый D-фенотип ча­сто обнаруживают у лиц с генотипом CDe/Cde и cDe/Cde [218, 329, 339,429].

Феномен ингибиции гена Д расположенного на одной хромосоме, генным комплексом Cde гомологичной хромосомы подтвержден другими авторами.

Гаплотип CdE в положении транс, как считают McGee и соавт. [470], так же как и гаплотип Cde, вызывает уменьшение продукции D-антигена.

То, что слабый D-антиген формируется в результате супрессирующего вли­яния гена С, стало ясно из семейных исследований. Ген D родителей, имевших слабый D-фенотип, кодировал у детей продукцию нормального D-антигена, ког­да передавался им по наследству с геном С в позиции цис. Наследование гена С в позиции транс сочеталось со слабым D-фенотипом.

Еще одно подтверждение высказанного положения: известно, что эритроциты лиц cDE/cDE, лишенные гена С, несут от 16 000 до 33 000 участков антигена D на одну клетку, а лица CDe/CDe - меньшее число антигенных участков - от 14 000 до 19 000.

Таким образом, существование слабого D-фенотипа у лиц, имеющих нор­мальный ген RHD, объясняется тем, что на экспрессию антигена D влияет ген С другого гаплотипа RH. Однако это правило не является абсолютным. Некоторые лица Cde/cDe имели слабый D-антиген, а на эритроцитах других людей с таким же генотипом D-антиген был выражен нормально [218, 612].

Второй механизм появления слабого D, серологически неотличимого от формы D^u, обусловлен отсутствием на полипептиде Rh некоторых эпитопов D. Необходимо отметить, что отсутствие одного или даже нескольких эпитопов не всегда проявляет себя как слабый D-фенотип. Большая часть эритроцитов с пар­циальными D-антигенами реагирует с анти-О-сыворотками так же активно, как если бы на веществе Rh присутствовали все эпитопы D [660, 661].

Третий механизм формирования слабого D связан с функцией редкого, с ча­стотой менее 0,1 %, аллеля RHD, который кодирует продукцию всех эпитопов D, но в меньшем количестве, чем обычно должно быть представлено на эритроцитах 'ШШ Такой тип слабого D хорошо прослеживается при семейных исследованиях,

дается от родителей детям [394,631,635]. При данном типе слабо­го D ген D не зависит от влияния гена С в положении транс или цис.

Молекулярно-биологические исследования лиц со слабым D-фенотипом по­зволили установить типичную для JWD-гена последовательность матричной

РНК с нормальной промоторной областью. Однако сравнительные исследо­вания с помощью ПЦР показали, что количество 1)-специфического транс­крипта у лиц со слабым D уменьшено. Низкая экспрессия D-антигена при сла­бом фенотипе D обусловлена, как полагают Beckers и соавт. [157] и Rouillac и соавт. [582], не мутациями в кодирующей последовательности RHD-гет, а уменьшением активности матричной РНК.

Другие исследователи (Wagner и соавт. [692]) отметили, что все образцы ге­номной ДНК, полученные от 16 лиц со слабым фенотипом D, высокогетероген-ны. Некоторые экзоны (4 и 5) в результате генной конверсии частично были за­мещены соответствующими последовательностями, характерными для RHCE-гена. Аминокислотные замены наблюдались в трансмембранном и внутри­клеточном сегментах протеина, но они не затрагивали экзофациалыгую часть, определяющую антигенную специфичность (табл. 4.11).

Считается, что при фенотипе D^u имеется селективная депрессия участ­ков гена D. При этом ген Сс/Ее не затронут. Указанная выборочная депрессия не связана с каким-либо повреждением структуры гена D и его промоторной последовательности в области от -600 до +41. Как показали Rouillac и соавт. [582], транскрипты генов D и D^u имели нормальную аминокислотную после­довательность, однако уровень D-экспрессии транскриптов у доноров D^u был в 4-5 раз ниже, чем в образцах с обычным фенотипом D. Экспрессия транскрип­тов СБ-гена была одинакова для лиц D^u и D+.

Не поврежденные по сравнению с нормой гены D и СЕ обнаружены у неко­торых лиц с фенотипом и Rh_null [214,233], что указывает на существование неизвестного пока регуляторного механизма помимо /?#-генного кодирования, который может влиять на экспрессию антигенов.

Вскоре после открытия D^u появились сообщения, что эритроциты со слабым D после трансфузии реципиенту D- могут вызвать у него продукцию анти-D-антител (Rosenfield и соавт. [578]), а реципиенты со слабым D-антигеном после переливания им резус-положительной крови с нормально выраженным антиге­ном D могут вырабатывать резус-антитела (Argall и соавт. [139]).

Ruffie и Carriere [588] получили анти-О-антитела в результате искусственной иммунизации добровольцев эритроцитами D^u.

В связи с подобными, однако не столь многочисленными наблюдениями, свиде­тельствующими об иммуногенности D^u, людей со слабым D-антигеном принято от­носить к D- если они являются реципиентами. Если люди со слабо выраженным D-антигеном (D^u) являются донорами, их причисляют к резус-положительным и их эритроциты переливают только резус-положительным больным.

Длительное время оставалось непонятным, почему в сыворотке крови лиц со слабым D-антигеном, имеющим количественное, но не качественное отличие от обычного D-антигена, могут присутствовать антитела анти-D.

Pietrusky [526] высказал предположение, что антиген D неоднороден и состо­ит из многочисленных парциальных вариантов: D_p D₂, D₃ и т. д. Полный набор парциальных вариантов соответствует полноценному D-антигену. Отсутствие какого-либо парциального фактора или одновременно нескольких факторов приводит к появлению ослабленных форм.

Лица, лишенные определенных парциальных антигенов, могут вырабаты­вать по отношению к ним антитела. В свою очередь сыворотки анти-D, по мне­нию Pietrusky, также могут содержать по отдельности или в разных комбинаци­ях антитела анти-D , анти-0₂, анти-0₃ и т. д. В связи с этим эритроциты со сла­бым D по-разному реагируют с набором сывороток анти-D. Некоторые образцы эритроцитов D^u агглютинируются одними и слабо или вовсе не агглютинируют­ся другими сыворотками, показывая большое разнообразие форм.

Серологические свойства эритроцитов D^u подробно изучены Т.М. Пискуновой [85, 86], обнаружевшей, что агглютинабельность эритроцитов D^u у разных лиц но­сителей этого фенотипа неодинакова. Она варьирует от очень слабой, выявляемой в антиглобулиновой пробе, до средней степени выраженности. В последнем случае антиген D может быть выявлен с помощью желатинового и других методов с при­менением коллоидов, а также в реакции агглютинации в солевой среде.

[Эритроциты со слабым D характеризуются низкой авидностью антигена и сниженной адсорбцией как полных, так и неполных анти-Б-антител. О низкой авидности антигена D^u можно судить по более легкой элюции антител анти-D с эритроцитов этого типа. В элюатах обычно присутствуют анти-О-антитела, идентичные тем, которые имелись в сыворотках, взятых для адсорбции. Элюаты с эритроцитов D^u и D по специфичности не отличаются. Последнее обстоятель­ство указывает на то, что антигены D^u и D качественно однородны. Какие-либо специфические анти-О^и-антитела не найдены.

Сегодня имеются все основания полагать, что лица, чей фенотип D^u обу­словлен генной ингибицией полипептида D (позиция транс гена RHC), а также лица, чей фенотип D^u обусловлен аллельным геном D", не могут вырабатывать анти-О-антитела, поскольку содержат все эпитопы D-антигена, хотя и в осла­бленной форме. Антитела анти-D (парциальные) могут вырабатывать лишь те люди, чей фенотип слабого, а также нормально выраженного D обусловлен от­сутствием нескольких важных для экспрессии антигена D эпитопов. Подобные варианты антигена правильнее относить к группе парциальных D-антигенов, а не к категории слабых D-фенотипов (собственно D^u). Такое разграничение принципиально важно для оценки значения этих двух групп антигенов в транс-фузиологии, поскольку специфические антитела к парциальным антигенам D являются реальностью, а антитела к антигену D^u до сих пор не найдены.

В настоящее время признано (Mollison и соавт. [476]), что продукция анти-D-антител лицами со слабым D-антигеном, получившими переливание крови D+, от­носительно редкое явление. Подавляющее большинство людей D+ не могут образо­вывать аллоиммунных анти-Б-антител. Такой же редкой является пгюдукция резус-антител лицами cde/cde после переливания им эритроцитов со слабым фенотипом D. о сводке Schmidt, Morrison и Shohl (цит. по Issitt и Anstee [374]), 45 ре­ципиентам D- было перелито 68 доз крови со слабым D и ни у одного из них не выработались анти-О-антитела. Крайне редко слабый D-антиген становил­ся причиной гемолитической болезни новорожденных. Тем не менее, боль­шинство специалистов-трансфузиологов разделяют мнение о том, что лиц D^u следует рассматривать как резус-положительных доноров, но как резус-отрицательных реципиентов.

Относительно применения у родильниц с фенотипом D^u иммуноглобулина анти-D с профилактической целью мнения расходятся. Одни авторы [394] пола­гают, что его назначать не следует в связи с редкостью такой сенсибилизации, а также с тем, что введенный препарат скорее всего адсорбируется на эритро­цитах женщины и не выполнит ожидаемой защитной функции. Другие высказывают опасение, что при рутинном определении резус-фактора в родильном Тв родильницы D^u будут фенотипированы как Rh- и им будет введен этот препарат понятно, что решение о введении анти-Б-иммуноглобулина родиль­ницам с фенотипом D^u требует индивидуального подхода и тщательного имму-носерологического обследования женщины в каждом конкретном случае.

Можно ожидать, что эритроциты людей с генотипом cDE/cDE будут нести больше антигенных участков сиЕ, чем эритроциты с генотипом Cde/cDE, по­тому что человек cDE/cDE имеет 2 гаплотипа, кодирующих продукцию этих ан­тигенов, а человек Cde/cDE - только один. Точно также лица CDe/CDe должны иметь в эритроцитах больше антигена С, чем лица CDe/cDe.

Разницу в количестве антигена иногда можно обнаружить титрованием сы­воротки анти-с, анти-Е или анти-С с соответствующими эритроцитами. При этом сыворотки нередко имеют более высокий титр с клетками, несущими двойную дозу антигена, и агглютинация с ними может быть выражена сильнее. Однако такой метод установления гомо- или гетерозиготности неточен из-за значительной вариабельности числа реагирующих антигенных участков на эри­троцитах людей с, казалось бы, одинаковым генотипом. Кроме того, далеко не со всеми сыворотками выявляют дозозависимый эффект.

Измерение количества того или иного антигена Rh у близких родственников позволило получить более точные результаты, так как имелась возможность с помощью серологических проб установить, кто из членов семьи гомо-, а кто ге­терозиготен по гену Д и замерить с помощью подобранных сывороток количе­ство антигена у этих лиц в сравнительном аспекте. Ген D в одной или двух ко­пиях у детей в пределах одной семьи очень точно дозирует одинарную и двой­ную порцию антигена [393, 576].

Lewis и соавт. [438], Chown, Lewis [218] предложили способ определе­ния гомо- и гетерозиготного варианта гена D по скорости реакции эритроци­тов со специально стандартизированными для этой цели сыворотками анти-D. Другие исследователи [463] различали гомо- и гетерозигот по количеству анти-D-антител, адсорбированных на их эритроцитах, используя для этого антигло-булиновые сыворотки, меченные ферритином. Такие методы в достаточной сте­пени приемлемы для идентификации гомо- и гетерозиготного варианта гена D у членов одной семьи, но дают весьма противоречивые результаты при определе­нии зиготности гена D у людей, не связанных родством.

Установление гомо- и гетерозиготности гена D и других генов групп крови имеет значение для прогнозирования ГБН у женщин, имеющих аллоиммунные антиэритроцитарные антитела (как правило, анти-D) и ранее родивших детей с ГБН. В таких случаях важно выяснить, является ли муж гомо- или гетерозигот­ным по гену D. В случае, если он гетерозиготен, например CDe/cde, а предыду­щая беременность женщины закончилась рождением ребенка Rh+, то с веро­ятностью 75 % можно прогнозировать, что при следующей беременности плод будет Rh-f*. Если при второй беременности, вопреки ожиданиям, снова родил­ся ребенок Rh+, то возможность рождения ребенка Rh- в третий раз возрастает до 90 %. В том случае, когда муж гомозиготен по гену Д все дети будут резус-положительными и родить здорового ребенка в такой семье будет проблематич­но, если вовремя не предпринять соответствующие меры: патронаж с ранних сроков беременности, наблюдение за динамикой антител, досрочное родоразре-шение кесаревым сечением.

В последние годы разработаны более надежные методы определения зи-готности в супружеских парах, а также методы определения резус-принад­лежности плода на ранних стадиях беременности по ДНК амниоцитов.

Наиболее надежным методом измерения количества антигенов Rh на эритро­цитах как членов одной семьи, так и неродственных лиц является проточная ци-тометрия с использованием МКА [339].

Для подсчета числа антигенных участков на эритроцитах ряд исследова­телей использовали радиоактивно меченные сыворотки с различной Rh-cne-цифичностью, а также меченные радиоактивной меткой или ферритином анти-глобулиновые сыворотки против IgG человека [189, 364, 464, 568, 635]. О числе участков судили по количеству меченого субстрата, связавшегося с эритроцита­ми. Результаты многих исследований в основном совпадали: гомозиготы содер­жали больше антигенных участков, чем гетерозиготы. Таким образом, эффект дозы в Rh-системе существует, хотя и не проявляет себя в 100 % случаев, что еще раз свидетельствует о полиморфизме системы.

Количество антигенных участков на 1 эритроцит (тыс. ау/эр) для каждого ан­тигена различно (см. табл. 4.10). У гомозигот DID - 14-33 тыс. ау/эр, у гетерози­гот D/d их количество меньше - 10-20 тыс. ау/эр. Причем у гомозигот CDe/CDe число D-антигенных участков на один эритроцит меньше (до 19 тыс. ау/эр), чем у гомозигот cDE/cDE (до 33 тыс. ау/эр), что обусловлено, как указано выше, по­зицией транс гена С. Лица с генотипом -D-/-D- имеют наибольшее количе­ство D-антигена (до 200 тыс. ау/эр), что, по-видимому, связано с отсутствием супрессирующего влияния на ген D других генов RH или же неясным пока ком­пенсаторным механизмом, направленным на замещение недостающих в мем­бране структурных элементов.

У гомо- и гетерозигот (СС и Сс, ЕЕ и Ее) прослеживается такая же зависи­мость: гомозиготы продуцируют больше антигена, чем гетерозиготы.

По количеству занимаемых участков антигены Rh-Hr распределяются в следу­ющей последовательности: c>C>D>E>e> Fy^a > G. Если сравнить эту после­довательность со шкалой иммуногенности антигенов Rh и других трансфузион-но опасных антигенов (D>K>E>c>C^w>e>C> Fy^a), то станет ясно, что коли­чество антигенных участков на эритроцитах не определяет степень иммуноген­ности того или иного антигена, по крайней мере, в рассматриваемой антигенной системе. Антиген с (hr^f), имеющий максимальное число антигенных участков на 1 эритроцит (до 85 тыс.), занимает четвертое место по степени своей иммуноген­ности после антигенов D (Rh_o), К (KEL1) и Е (rh^ff), имеющих значительно мень­ше (от 3 тыс. до 33 тыс.) антигенных участков. В то же время антиген К, имею­щий 3,5 тыс. ау/эр, стоит на втором месте после наиболее иммуногенного факто­ра - D. Антиген С (rh'), представленный 56 тыс. ау/эр, занимает лишь седьмое ме­сто в шкале иммуногенности, а антиген Fy^a отстоит от антигена К на 6 позиций.

Итак, степень иммуногенности того или иного субстрата обусловлена в пер­вую очередь качественным составом. Однако нельзя полностью исключить воз­можную зависимость иммуногенности от количества антигена, например отсут­ствуют данные о степени иммуногенности эритроцитов сс и сС, имеющих соот­ветственно 85 и 37 тыс. ау/эр, для реципиентов СС. Можно предположить, что в большой выборке сравнительных наблюдений иммуногенность эритроцитов сс окажется большей, чем эритроцитов сС, а иммуногенность эритроцитов DD лиц cDE/cDE - большей, чем эритроцитов Dd лиц CDe/cde.

количество А-антигенных участков на эритроцитах А(П) - 810-1170 тыс. ау/эр, В-антигенных участков на эритроцитах В(Ш) - 810-1170 тыс. ау/эр, К-антигенных участков на эритроцитах К/К- 6 тыс. ау/эр, К-антигенных участков на эритроцитах К/k - 3 тыс. ау/эр, Ру^а-антигенных участков на эритроцитах Fy^a - 12 тыс. ау/эр.

Количество антигенных участков D у лиц с различным сочетанием антигенов Rh-Hr.

Меньше всего антиген D выражен на эритроцитах с парциальными D-анти-генами у лиц R^N, R^Har, а также на эритроцитах D_el, где антиген D выявляют только с помощью адсорбции - элюции при использовании особо активных сы­вороток анти-D. В то же время эритроциты с парциальным антигеном категории D^IV реагируют сильнее с сыворотками анти-D, чем обычные клетки D+, несмо­тря на то, что они не содержат многих D-эпитопов.