Изомеры гликопротеина удалось выделить из мембраны эритроцитов по­средством иммунопреципитации моноклональными антителами анти-Ьи^ь, а также анти-ЬиЗ, -Lu4, -Lu6, -Lu8, -Lul2, -Au^a, -Au^b (Daniels и соавт. [33, 38], Parsons и соавт.[106]). Указанные компоненты отсутствовали в цитоскелете эри­троцитов Lu_nuU.

Отмечено некоторое снижение мол. массы гликопротеинов после обработ­ки сиалидазой (Daniels и соавт. [38]). Гликопротеины разрушались сульфидре-дуцентами, что указывало на наличие в их структуре дисульфидных связей. Обработка мембран эритроцитов эндогликозилазой-F приводила к появлению 2 компонентов с мол. массой 73 и 66 кДа, что было связано с утратой части jV-связанных олигосахаридных цепей (Parsons и соавт. [106]).

Parsons и соавт. [105], изучив аминокислотную последовательность полипеп­тида LU, создали олигонуклеотидные праймеры и с помощью ПЦР выделили клон ДНК (2417 пн) из библиотеки ДНК плаценты человека. Кодируемый про­теин с мол. массой 85 кДа состоял из 597 аминокислот; 518 из них составляли экстрацеллюлярные домены, 19 - трансмембранный домен, 59 - цитоплазмати­ческий. Цитоплазматический участок протеина непосредственно связан с цито-скелетом (Gane и соавт. [55]).

Изомер с мол. массой 78 кДа лишен части цитоплазматического домена (Parsons и соавт. [105]). Позднее было показано, что антиген эпителиального рака (В-САМ) также представляет собой изоформу гликопептида с мол. массой 78 кДа (Campbell и соавт. [18], Rahuel и соавт. [115]).

Гликопротеины LU отсутствуют на лейкоцитах, но в то же время имеются на многих других клетках в виде нескольких повторяющихся экстрацеллюляр-ных доменов, имеющих высокую гомологию с иммуноглобулинами. Подобно последним они имеют вариабельные (V) и константные (С1 и С2) домены.

Каждый из доменов состоит приблизительно из 100 аминокислот и структури­рован в виде двух р-цепей, связанных между собой дисульфидными мостиками. Считается, что эти гликопротеины выполняют функцию молекул межклеточной адгезии и участвуют в передаче межклеточных сигналов (Barclay и соавт.[7], Williams, Barclay [147]). Экстрацеллюлярный домен гликопротеинов LU состо­ит из двух вариабельных и трех константных доменов (см. рис. 8.1). Имеется 5 потенциальных участков JV-гликозилирования: один - в домене 3, остальные - в домене 4. Рядом с веществом LU на мембране эритроцитов присутствуют дру­гие гликопротеины, также являющиеся рецепторами межклеточной адгезии: LW, CD147 (групповая система Ok), CD47 и CD58 (LFA-3).

Parsons и соавт. [104] сконструировали кДНК с делениями, при которых глико­протеин LU синтезировался без одного, двух, трех или четырех доменов. Образцы таких дефицитных гликопротеинов авторы исследовали в проточной цитофлюо-рометрии с антителами анти-LU разной специфичности, что позволило устано­вить локализацию антигенных эпитопов на том или ином домене (см. рис. 8.1).

Таблица 8.2

Организация гена LU

Ген LU состоит из 15 экзонов размером 12,5 кб (см. рис. 8.1, табл. 8.2). Экзон 1 кодирует сигнальный пептид, экзоны 2-12 кодируют 5 доменов; вариабельный ^Н^Е кодируется экзонами 4, 5 и 6. Экзон 13 кодирует трансмембранный домен.

обеих изоформ гликопротеина LU; экзоны 14 и 15 - терминальный участок, со­стоящий из 40 аминокислот (см. табл. 8.2). Терминальный участок присутствует только в изоформе с мол. массой 85 кДа (El Nemer и соавт. [51], Parsons и соавт. [104]). Выделены два транскрипта гена LU. Один из них, величиной 2,5 кб, коди­ровал гликопротеин с мол. массой 85 кДа, другой гликопротеин, величиной 4,0 кб, кодировал гликопротеин 78 кДа (Rahuel и соавт. [115]). Транскрипты отличались альтернативным сплайсингом интрона 13. В транскрипте 2,5 кб интрон 13 отсут­ствовал, экзоны 14 и 15 кодировали С-терминальный участок из 40 аминокислот.

Как и другие групповые системы эритроцитов, система Lutheran может быть представлена нулевым фенотипом. Фенотип Lu_null, впервые описанный Crawford и соавт. [27] в 1961 г. как Lu(a-b-), возникает вследствие трех причин:

•  гомозиготность по рецессивному аллелю LU-;
•  наличие доминантного супрессорного гена In(Lu) независимого от LU;
•  гомозиготность по Х-сцепленному супрессорному гену.

Истинным нулевым фенотипом является первый из указанных в табл. 8.3, поскольку только в этом случае отсутствие антигенов LU обусловлено соб­ственно геном LU₉ в 2 других случаях следовые количества вещества Lutheran на эритроцитах удается выявить специальными методами исследования.

Таблица 8.3

Характеристика фенотипа Lu_null

Фенотип Lu_null преимущественно обусловлен доминирующим геном In(Lu). Так, при исследовании 50 семей, среди членов которых имелись лица Lu_null, доминантный тип наследования супрессорного гена был доказан в 41 случае. В 9 других случаях причину фенотипа Lu_null точно установить не удалось, хотя серологические данные (наличие следовых количеств групповых субстанций Lutheran) также указывали на наследование супрессорного гена (Rowe и соавт. [118], Shaw и соавт. [123]).

Несколько обширных исследований, проведенных в Англии Darnborough и со­авт. [41], Gibson [57], Rowe и соавт. [118], Shaw и соавт. [123], позволили устано­вить частоту фенотипа Lu_null - 0,005-0,012 % (табл. 8.4). Среди негров Детройта (США) этот показатель соответствовал 0,027 % (Winkler, Hamilton [149]), у до­норов Хьюстона (США) - 0,02 % (Udden и соавт. [145]); у жителей Портленда частота фенотипа Lu_nuI1 - 0,12 % (Lukasavage [82]). В последнем случае данные могут быть не совсем точными, поскольку автор использовал сыворотку, содер­жащую антитела анти-AnWj к часто встречающемуся антигену Anton (Lul5), ко­торый на протяжении ряда лет считали частью системы Lutheran. Broadberry и соавт. [14] нашли фенотип Lu   у китайцев.

Таблица 8.4

Частота фенотипа Lu    в некоторых популяциях

axas и соавт. [93]). В большинстве случаев антитела анти-Ьи^ь являлись сме­сью IgM и IgG, некоторые сыворотки содержали также фракцию IgA (Adkins [3], Dube, Zoes [43], Mollison и соавт. [94], Peters и соавт. [108]). Анти-Ьи^ь чаще были представлены субклассом IgGl, однако встречались также IgG2 и IgG4 (Hardman, Beck [65], Herron и соавт. [69], Novotny и соавт. [102]).

Описаны 2 образца мышиных моноклональных антител анти-Ьи^ь, которые не были идентичны аллогенным. В тестах адсорбции - элюции они частично реагировали с эритроцитами Lu(a+b-) и Lu_null (Daniels [35], Inglis и соавт. [71], Judson и соавт. [75], Telen [135]).

Анти-ЬиЗ

Всех индивидов с рецессивным типом Lu удалось выявить по наличию в их крови антител к антигену с очень высокой частотой встречаемости. Эти антитела первоначально были обозначены как анти-Ьи^аЬ и позднее - анти-ЬиЗ (Bove и соавт. [12], Melonas, Noto [91]). Указанные антитела не являются про­стой смесью анти-Ьи^а и анти-Ьи^ь и реагируют одинаково интенсивно с эритро­цитами Lu(a-b+) и Lu(a+b-) и могут быть адсорбированы клетками любого из указанных фенотипов. Адсорбция антител эритроцитами Lu(a-b+) полно­стью устраняла их способность агглютинировать эритртроциты Lu(a+b-), а адсорбция эритроцитами Lu(a+b-) устраняла их способность агглютиниро­вать эритроциты Lu(a-b+) (Darnborough и соавт. [41], Myhre и соавт. [100]). Антиген Lu3 всегда присутствует на эритроцитах, если они экспрессируют какой-либо из антигенов системы Lutheran. Эритроциты лиц с другими ти­пами Lu_null (доминантным и Х-связанным) не агглютинируются антителами анти-ЬиЗ, однако способны их адсорбировать, что было показано с помощью адсорбции - элюции.

Имеются сообщения о получении мышиных моноклональных антител, спец­ифичность которых близка к анти-ЬиЗ. Указанные антитела реагировали со все­ми образцами эритроцитов, за исключением Lu_null (Parsons и соавт. [105], Telen [135], Zelinski и соавт. [154]).

Обнаружение антител анти-ЬиЗ в сыворотке крови одной американской не­гритянки давало основания полагать, что она имела рецессивный тип Lu_nulI, од­нако при обследовании ее семьи это доказать не удалось (Melonas, Note [91]).

Дополнительные сведения в пользу существования молчащего аллеля Lu были получены Brown и соавт. [15]. Авторы нашли семьи, в которых родители Lu(a+b+) х Lu(a-b+) имели детей с фенотипом Lu(a+b-). Вероятно, в этих случаях имела место гетерозиготность родителей Lu(a-b+) по гену Lu'. В браках родителей Lu^a/Lu^bх Lu^b/Lu~ были дети Lu^a/Lu~₉ что фенотипически проявлялось как Lu(a+b-).

На эритроцитах лиц с рецессивным типом Lu_null все, без исключения, анти­гены системы Lutheran отсутствуют. Их не удавалось обнаружить методом ад­сорбции - элюции.

В одной японской семье пробанд Lu(a-b-), имевший антитела анти-ЬиЗ, оказался гомозиготным по нонсенс-мутации С 733 А в экзоне 6 гена LU. Последняя преобразует кодон Cys 237 в стоп-кодон (Mallinson и соавт. [85]). Родители пробанда были гетерозиготными по указанной мутации.

Lu_null доминантного типа

Обследование трех поколений семьи первого из выявленных пробандов Lu_nullпоказало, что этот признак находится под контролем гена, имеющего доминантный тип наследования (Crawford и соавт. [27]). Позднее появились другие аналогичные сообщения (Contreras, Tippett [25], Gibson [57], Rowe и соавт. [118], Shaw и соавт. [123], Stanbury, Francis [133], Taliano и соавт. [134], Wright, Moore [150]).

В отличие от лиц Lu _u рецессивного типа, которых выявляли случайно в свя­зи с наличем у них антител, лиц Lu " доминантного типа обнаруживали при плановом фенотипировании доноров сыворотками анти-Lu³ и aHra-Lu^b.

В обследованных семьях 52 пробанда Lu_null имели 63 сибса Lu_null и 61 сибса не Lu_null (Gibson [57], Race, Sanger [113], Rowe и соавт. [118], Shaw и соавт. [123]). Статистический анализ результатов обследования детей у ро­дителей Lu_null х He-Lu_null показал, что соотношение частоты фенотипов рав­но 1:1. Таким образом, имелись все основания полагать, что ген Lu „ является кодоминантным.

Taliano и соавт. [134] обозначили супрессорный ген, приводящий к Lu_nп доминантного типа, буквами In(Lu). Авторы предположили, что должен су­ществовать его аллель in(Lu), не оказывающий супрессорного эффекта на антигены системы Lutheran. Однако последующее открытие супрессорно­го действия In(Lu) на антигены Р1 и i, не входящие в систему Lutheran, по­будило Race и Sanger [113] высказать сомнения относительно концепции Taliano и соавт.

Marsh и соавт. [89] предлагали переименовать In(Lu) в SYN-1 и SYN-1В, нарушающие нормальный биосинтез некоторых групповых антиге­нов, и SYN-1A, в присутствии которого биосинтез происходит нормально.

Эта номенклатура была признана неудовлетворительной, поскольку в ней подразумевалось, что ген In(Lu) модифицирует биосинтез на уровне субстанций-предшественников, в то время как механизм действия этого гена неизвестен (Shaw, Tippett [124]). По этой причине в настоящее время предпочитают использовать обозначения In(Lu) (для гена) и In(Lu) (для фе-нотипических проявлений).

Эритроциты лиц, имеющих ген In(Lu), не обладают истинным феноти­пом Lu_null, поскольку способны адсорбировать антитела системы Lutheran (Moulds, Shah и соавт. [97], Stanbury, Francis [133], Telen и соавт. [136], Tippett [139]). Однако отрицательные результаты экспериментов с адсорбцией - элю-цией антител системы Lutheran нельзя расценивать как абсолютное доказа­тельство того, что обследуемый относится к группе Lu _п рецессивного типа.

Некоторым исследователям не удавалось элюировать антитела Lutheran с эритроцитов In(Lu) (Crawford и соавт. [27], Wright, Moore [150]).

В то же время адсорбция - элюция антител aHTH-Lu^a и aHTH-Lu^b позволяют выявить истинный рецессивный тип Lu_null у некоторых лиц In(Lu). Посемейные исследования выявили рекомбинацию генов LU и In(Lu) (Taliano et. al. [134]). На рис. 8.2 представлена родословная семьи, показывающая независимость су­прессорного гена In(Lu) от локуса LU. Исследования в других семьях позволи­ли установить рекомбинации In(Lu) и генов, контролирующих системы АВО, MNS, PI, Rh, Kell, Kidd, Cartrwrigh, Colton, Se и HLA (Rowe и соавт. [118], Shaw и соавт. [123]). Статистический анализ подтвердил отсутствие коррелятивной связи гена In(Lu) с перечисленными локусами групп крови.

О выявлении каких-либо антител системы Lutheran в сыворотках крови лиц, имеющих фенотип In(Lu), ни разу не сообщалось. Вероятно, иммунная система таких индивидов не реагирует на антигенные детерминанты указан­ной системы как на чужеродные. Антитела не были найдены в сыворотках крови 12 женщин группы In(Lu), родивших детей с нормально выраженны­ми антигенами Lu (Shaw и соавт. [123], Wright, Moore [150]).

Ген In(Lu) подавляет синтез антигенов Lutheran. Кроме того, на эритроцитах лиц In(Lu) снижена экспрессия ряда других антигенов, не относящихся к систе­ме Lutheran. Интересен тот факт, что у индивидов с рецессивным типом Lu_nullэти антигены выражены нормально.

Присутствие гена In(Lu) вызывает супрессию антигена Р1, хотя этот эф­фект менее выражен, чем в отношении факторов Lutheran. Crawford и со­авт. [27], Gibson [57], Shaw и соавт. [123] привели данные обследования 236 человек, членов 41 семьи, среди которых были индивиды In(Lu) (табл. 8.5). Распределение антигенов ¥_х и Р₂ среди носителей фенотипа In(Lu) существен­но отличалось от распределения этих антигенов у лиц с фенотипом He-In(Lu). У 36 лиц Lu_null антиген ?_х был выражен нормально, что могло быть обусловле­но присутствием высокоактивного аллеля Р1⁺, или гомозиготностью по нему, или обеими причинами одновременно. У лиц с рецессивным типом Lu л вы­раженность антигена ?_х также не отличалась от нормы. В 3 семьях у родите­лей P₂Lu_null х P₂Lu(a-b+) были дети PjLu(a-b+), что подтверждает ингибиру-ющий эффект гена In(Lu) на ген Р¹

Наследование фенотипа In(Lu) в семье жителей о. Сардиния. Италия. Ген In(Lu) (черные фигуры) и фенотипы членов семьи по системе Р1 [25]. Члены семьи II-1 и Ш-4 имеют фенотип Р₂ в отсутствие теш1п(Ьи)₉ в то время как 1-2 имеет фенотип Pj и обладает геном In(Lu), 1-2, вероятно, гомозиготна по гену Р1 • поэтому экспрессирует Р1 в присутствие тев&1п(Ьи).

Ген In(Lu) угнетает также экспрессию антигенов системы Knops: Кп^а, МсС^а, Sl^a и антигенов Yk^a, Cs^a коллекции 205 Cost (Daniels и соавт. [40]). Известно,

что указанные антигенные детерминанты являются рецепторами компонентов СЗ/С4 системы комплемента, CR1 (CD35), однако In(Lu) не влияет на экспрес­сию CR1 (Moulds, Shah [97]).

Ингибирующий эффект In(Lu) установлен также в отношении антигена MER2 системы RAPH (Daniels [36]).

Интересный феномен, связанный с фенотипом по системе Lutheran, обна­ружен в экспериментах с лошадиным антилимфоцитарным иммуноглобули­ном, который применяют в трансплантологии для профилактики кризов от­торжения. Оказалось, что он значительно слабее реагирует с эритроцитами In(Lu) по сравнению с любыми другими, включая Lu_null (Anderson и соавт. [4], Postoway, Garratty [112]).

Слабая агглютинация эритроцитов In(Lu) отмечена также с конканавали-ном А - растительным лектином, агглютинирующим эритроциты человека. Указанный лектин реагирует главным образом с протеином полосы 3 (band 3 protein), транспортером анионов. В связи с этим высказано предположение, что гликозилирование анионных транспортеров на клетках In(Lu) отличается от нормального (Udden и соавт. [145]).

Вместе с тем на эритроцитах имеется уникальная структура - CDw75, вы­раженность которой усиливается в присутствии гена In(Lu). Этот лиганд, по­мимо эритроцитов, содержится в лимфоцитах и распознается моноклональ-ными антителами. Биохимическая природа и физиологические функции эпи-топа CDw75 до конца не выяснены, известно лишь, что для его экспрессии необходимо присутствие N-гликанов с остатками а2,6-сиаловых кислот (Bast и соавт. [8], Guy и соавт. [63, 64]). Эпитоп CDw75 выражен нормально на эритроцитах лиц Lu_null рецессивного типа, но отсутствует у индивидов Lu_nullХ-ассоциированного (Tippett, Guy [141]). На эритроцитах пуповинной крови CDw75 отсутствует.

Лица, имеющие фенотип In(Lu), соматически здоровы и не обнаруживают каких-либо признаков анемии (снижение уровня гемоглобина, ретикулоцитоз), хотя у членов трех семей, наследовавших In(Lu), имелся акантоцитоз (Ballas и соавт. [6], Udden и соавт. [145]). Выживание аутологичных эритроцитов In(Lu) in vivo было нормальным (Ballas и соавт. [6]), осмотическая резистентность эри­троцитов соответствовала норме. Инкубация эритроцитов In(Lu) в плазме в те­чение 24 ч при 37 °С повышала их осмотическую резистентность. При этом от­мечали утрату значительной части ионов калия и относительное повышение со­держания натрия; в целом концентрация катионов снижалась. Эти изменения позволяют объяснить повышение осмотической резистентности (Udden и соавт. [145]). Выраженный гемолиз эритроцитов In(Lu) наблюдали при хранении их в растворе Алсевера (глюкозидцитратный консервант для эрмассы) при 4 °С, раз­рушение клеток уменьшалось после добавлении глюкозы или АТФ.

По мнению Tippett [140], ингибирующий эффект гена In(Lu)₉ оказываемый одновременно на несколько различных локусов, контролирующих групповые антигены эритроцитов, является уникальным. Моделей, которые могли бы объ­яснить этот феномен, пока не предложено.

Marcus и соавт. [86] высказали предположение, что Lu_null доминантного типа может быть результатом действия гликозилтрансферазы, присоединяющей до­полнительные сахара к структуре-предшественнику.

Udden и соавт. [145] полагают, что частичное редуцирование рецепторов для конканавалина А на эритроцитах In(Lu) обусловлено необычным гликозижровани-ем углеводных последовательностей, общих для гликопротеинов и гликолипидов.

Shaw и Tippett [124] считают, что в присутствии In(Lu) могут возникать кон-формационные изменения некоторых мембранных структур, затрудняющие их связывание с антителами.

По мнению Daniels и соавт. [40], ген In(Lu) кодирует ДНК-связывающий про­теин или какой-либо из факторов транскрипции, ингибирующий функции ге­нов, ответственных за синтез мембранных структур.