К гликофоринам относят гликопротеины с высоким содержанием сиаловых кислот. Они идентифицируются посредством электрофореза в додецилсульфат-ном полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Большая часть гликофоринов мем­браны эритроцитов (более 90 %) представлена вариантами А и В. Эти гликофо­рины несут антигены системы MNS.

Меньшую по величине долю (около 7 %) составляют два других высокого­мологичных варианта гликофорина - С и D. Их представительство в мембране эритроцитов составляет 6 и 1 % соответственно (Furthmayr [33]). Гликофорины С и D несут антигены Gerbich.

Гликофорины А и В не связаны с гликофоринами С и D. Их синтез контроли­руют гены, расположенные на разных хромосомах.

Гликофорин С известен как протеин CD236C, р- и у-сиалогликопротеин, PAS-2'. Гликофорин D имеет синонимы: компонент D и компонент Е.

Мол. масса гликофоринов С и D 40 и 30 кДа соответственно (Reid [92], Colin, Le Van Kim [17], King [46]). Исследования с использованием Fab-фрагментов МКА к антигенам Gerbich показали, что один эритроцит содержит 143 тыс. мо­лекул гликофорина С и 82 тыс. молекул гликофорина D (Smythe и соавт. [115]).

Расшифрована аминокислотная последовательность гликофоринов С и D (рис. 20.1) (Colin и соавт. [19], Dahr и соавт. [20]). аминокислотные последовательности трансмембранного домена, двумя линиями -участки связывания для протеинов 4.1R и р55 соответственно.

Аминокислотная последовательность гликофоринов С и D

Аминокислотная последовательность гликофорина D определена частично, поскольку N-терминальный участок его блокирован (El-Maliki и соавт. [32]). Гликофорин D представляет собой укороченный вариант гликофорина С без N-терминальной последовательности из 21 аминокислоты. Он идентичен глико­форину С по аминокислотам в позициях 22-128.

Гликофорин D не имеет участков N-гликозилирования, поскольку не содер­жит N-терминального домена (Dahr и соавт. [21]). Антиген Ge3, представлен­ный аминокислотной последовательностью в позициях 40-50 на гликофорине С, присутствует также на гликофорине D (High и соавт. [39]);

Антигенные детерминанты, распознаваемые ксеногенными моно- и поликлональными антителами, расположены на цитоплазматических доменах гликофоринов С и D.

Поскольку гликофорин D является укороченным аналогом гликофорина С анти-Ое2-антитела могут распознать аминокислотную последовательность, если она находится на N-терминальном участке гликофорина D, но не на гомологич­ном участке гликофорина С. Вместе с тем в образовании эпитопа Ge2 могут уча­ствовать свободные аминогруппы гликофорина D. Некоторые образцы анти-Ое2-антител не реагируют с эритроцитами, обработанными уксусным ангидридом. Это дает основание полагать, что аминогруппы также вовлечены в формирова­ние эпитопов, распознаваемых анти-Ое2-антителами. Анти-Ое2-антитела, по-видимому, являются гетерогенными и распознают эпитопы на разных участках гликофорина D, в том числе на N-терминальном участке (Daniels и соавт. [28]).

Подобно антигену Ge2, антиген Ge3 разрушается трипсином. К химотрипси-ну и проназе он устойчив. В отличие от Ge2 антиген Ge3 устойчив к действию папаина (Mohammed и соавт. [70]). Соответственно эритроциты, обработанные папаином, можно использовать для дифференциации антител aHTH-Ge2 от анти-Ge3 при отсутствии эритроцитов редкого фенотипа Ge:-2,3,4.

Методом иммуноблоттинга с МКА было показано, что эпитопы Ge3 локали­зуются на гликофоринах С и D (рис. 20.6) (Dahr и соавт. [22], Loirat и соавт. [56, 57], Reid и соавт. [94], Smythe и соавт. [115]). Аллоиммунные анти-веЗ-антитела удавалось элюировать с гликофоринов обоих типов (Reid и соавт. [94]).

Антиген Ge3 кодируется экзоном 3 GYPC. При делеций указанного участка ан­тиген Ge3 отсутствует. Делеция экзона 2 не приводит к исчезновению экспрессии Ge3. Экзоны 2 и 3 имеют большое сходство и различаются лишь вставкой из 27 нуклеотидов, кодирующих аминокислоты в позициях 42-50 на гликофорине С и 21-29 - на гликофорине D, поэтому эпитопы Ge3 присутствуют именно в указан­ных областях соответствующих гликофоринов (Dahr и соавт. [22]).

Антиген Ge4 располагается в N-терминальной части гликофорина С (см. рис. 20.6). На гликофорине D он отсутствует (Anstee и соавт. [4, 5], Dahr и соавт. [21], Daniels и соавт. [29]).

Детальный анализ специфических МКА показал, что некоторым из них для свя­зывания эпитопами Ge4 требовалась аминогруппа в позиции Metl на гликофорине С. В то же время другие МКА распознавали эпитопы среди первых 20 аминокислот гликофорина С и Metl в реакцию вовлечен не был (Anstee и соавт. [5], Dahr и соавт. [21]). Более значимым для связывания антител оказалось О-гликозилирование гли­кофорина С. Антиген Ge4 разрушается трипсином и папаином.

Несмотря на высокую степень гомологии гликофоринов С и D, гомолог гена GYPC на уровне кДНК идентифицировать не удалось. Это свидетель­ствует о том, что самостоятельного гена, контролирующего синтез глико­форина D, не существует. Оба типа гликофоринов кодирует один и тот же ген GYPC (Le Van Kim и соавт. [52], Tanner и соавт. [120]). Как установи­ли Tanner и соавт., различия гликофоринов С и D обусловлены мутацией иРНК гена GYPC, в результате чего трансляция начинается с двух разных то­чек, соответственно, синтезируются два гомологичных полипептида разной длины.

Неравновесный кроссинговер, приводящий к возникновению необыч­ных вариантов гена GYPC

Структура гена GYPC

Трансляция начинается с AUG-кодона (метионина), представлен­ного в ДНК триплетом AEG. Вновь синтезированные полипепти­ды имеют метионин в N-области, хотя последний отщепляется от зрело­го протеина. Последовательность РНК вблизи стартового кодона гликофори­на С (CCAGGAAUGU) отдалена от стартовой последовательности (CC(A/G) CCAUGG). Последовательность (CCGGGGAUGG) кодона метионина в пози­ции 22 на гликофорине С находится ближе к стартовому участку (Tanner и со­авт. [120]). Таким образом, первая стартовая точка (для метионина в позиции 1).

Второй участок, с ко­торого может начаться трансляция, кодирует метионин в позиции 22. В этом случае синтезируется гликофорин D, который, как отмечалось выше, идентичен гликофорину С в позициях 22-128 (см. рис. 20.3). Возможность двух вариантов трансляции одного и того же гена подтверждена экспериментами с трансфек-цией кДНК GYPC в клетки COS-7. Указанные клетки продуцировали оба типа гликофоринов. Трансфекция этой линии кДНК с делециями ATG (кодона мети­онина) приводила к продукции только гликофорина D. В случае замены ATG на ACG в позиции 22 синтезировался гликофорин С. В случае замены обоих ко-донов ATG в позициях 1 и 22 гликофорины не синтезировались. Мутация в ну­клеотиде 4 (ATG Т pi ATG G) повышала экспрессию гликофорина С в 2 раза по сравнению с выраженностью гликофорина D (Le Van Kim и соавт. [54]).

Ген GYPC представлен четырьмя экзонами общей протяженностью 13,5 кб (см. табл. 20.2, рис. 20.2) (Colin и соавт [18], High и соавт. [39]).

Экзоны 1-3 кодируют экстрацеллюлярные домены гликофоринов С и D, экзон 4 - трансмембранный и цитоплазматический домены. Экзоны 2 и 3 имеют
высокую степень сходства, что объясняется происхождением экзонов путем дупликации, хотя при этом экзон 3 содержит вставочную последовательность из 27 пар нуклеотидов, которой нет в экзоне 2. Указанная вставка кодирует аминокислоты в позициях 42-50 гликофорина С (Colin и соавт. [16]), Le Van Kim и соавт. [53]).

На рис. 20.4 и 20.5 представлена схема неравновесного кроссинговера и ва­рианты гена GYPC, приводящие к возникновению редких антигенов и феноти­пов Gerbich.

Gerbich-отрицательные фенотипы у европеоидов крайне редки. При обследо­вании более 45 тыс. европейцев Gerbich-отрицательный фенотип выявлен лишь у одного (табл. 20.4). Существенно чаще люди, лишенные антигенов Gerbich, встречаются среди жителей Папуа - Новой Гвинеи.

Многие Gerbich-отрицательные лица выявлены в связи с присутствием в сы­воротке их крови антител Gerbich (Anstee и соавт. [5], Barnes, Lewis [6], Daniels

и соавт. [29, 3], McLouglin, Rogers [66], Muller и соавт. [74], Nunn и соавт. [78], Okubo и соавт. [81], Peddle и соавт. [87], Reid и соавт. [91, 98], Rosenfield и соавт. [106], Rountree и соавт. [107], Sacks и соавт. [108]).

Фенотип Yus (Ge: -2,3,4) встречается реже, чем Ge:-2,-3, но такое соотно­шение может отражать лишь неодинаковую способность лиц с указанным фено­типом к антителообразованию (Daniels [25], Reid и соавт. [91]).

Лица Ge:-2,3,4 были обнаружены среди арабов, турок-киприотов и евреев, а также у негров.

Исследования посредством SDS-PAGE и иммуноблоттинга с МКА показано, что эритроциты Ge:-2,3,4 не содержат гликофорины С и D. Однако они несут гликофорин-С-подобную структуру с мол. массой 32,5-36,5 кДа, промежуточ­ную между гликофоринами С и D (Anstee и соавт. [5], Dahr и соавт. [23], Reid и соавт. [94]). В эритроцитах гетерозигот GYPC'/GYPC. Yus гликофорины С и D присутствуют (Reid и соавт. [ 102]).

Анализ геномной и кодирующей ДНК показал, что лица Ge:-2,3,4 гомози­готны по гену GYP С. Yus, в котором экзон 2 подвергся делеций (Chang и соавт. [13], High и соавт. [39], Johnson, Daniels [44]). Продуктом указанного гена яв­ляется гликофорин-С-подобный протеин без аминокислот в позициях 17-35, экспрессия антигенов Ge3 и Ge4 при этом сохранена. Вторая стартовая точка трансляции (Met 22) отсутствует, поэтому не происходит синтеза гликофорина D, несущего антиген Ge2.

Локализация эпитопов Ge2-4 на гликофорине С и D

Частота Gerbich-отрицательных фенотипов у разных народов

Фенотип Ge:-2, 3, 4 может быть также результатом гетерозиготности по GYPC.Yus/GYPC.Ge (Loirat и соавт. [58], Moulds и соавт. [72]). У 5 из 10 лиц Ge:-2, 3 определялись оба типа гликофоринов - Yus и Ge (Moulds и соавт. [72]).

Фенотип Ge:-2,-3,4 является типичным Gerbich-отрицательньш. Он оказал­ся полиморфным в некоторых районах Папуа - Новой Гвинеи (Booth, McLouglin и соавт. [11]). В других географических зонах земного шара фенотип Ge:-2,-3 встречается крайне редко, лишь в единичных случаях он был найден у европео­идов и негроидов, а также у монголоидов (японцев) и австралоидов (полинезий­цев). Посемейные исследования показали, что гены, обусловливающие фенотип Ge:-2,-3, передаются по наследству (Nunn и соавт. [78], Okubo и соавт. [81], Reid и соавт. [100,102], Rosenfield и соавт. [106]).

Подобно эритроцитам Ge:-2,3,4, эритроциты Ge:-2,-3 не содержат глико­форины С и D, однако несут гликофорин-С-подобную структуру GPC.Ge с мол. массой 30,5-34,5 кДа, несколько меньшей по сравненю с мол. массой GPC.Yus. По электрофоретической подвижности вещество GPC.Ge занимает промежу­точное положение между гликофоринами С и D (Anstee и соавт. [5], Dahr и со­авт. [23], Reid и соавт. [94]). Гликофорин Gerbich-типа (GPC.Ge) содержит анти­ген Ge4, антиген Ge3 в нем отсутствует (Anstee и соавт. [5], Reid и соавт. [94]). В отличие от гликофоринов С, D и GPC.Yus, GPC.Ge устойчив к действию трип­сина (Anstee и соавт. [5]). Моноклональные антитела к GPC.Ge (aHTH-Ge4) аг­глютинируют эритроциты Ge:-2,-3,4, обработанные трипсином. Они также аг­глютинируют эритроциты лиц, гетерозиготных по гену Ge~^2,~^3,4.

Фенотип Ge:-2,-3,4 возникает в результате делеций экзона 3 GPC (Colin и соавт. [18], Chang и соавт. [13], High и соавт. [39], Loirat и соавт. [58], Serjeantson и соавт. [ПО]). Аллель GPC.Ge кодирует гликофорин-С-подобную структуру, лишенную аминокислот в положениях 36-63. GPC.Ge несколько меньше глико­форина GPC.Yus, поскольку экзон 2 лишен вставки из 27 нуклеотидов, присут­ствующей в экзоне 3.

Еще один Gerbich-отрицательный фенотип, Ge:-2,-3,-4, получил обозначе­ние Leach. Он является истинно нулевым фенотипом: эритроциты лиц с указан­ной редкой группой крови лишены всех антигенов системы Gerbich. В литера­туре имеются описания шести лиц Ge:-2,-3,-4. Все они оказались европеоида­ми (англичане, американцы) (Anstee и соавт. [5], Daniels и соавт. [30], McShane, Chung [67], Reid и соавт. [98], Rountree и соавт. [107]).

В двух семьях удалось показать наследование рецессивных генов, обусловливающих возникновение фенотипа Ge:-2,-3,-4 (Daniels и соавт. [30], Reid и соавт. [98]). На эритроцитах лиц с этой крайне редкой группой крови гликофорины С и D полностью отсутствуют (Anstee и соавт. [5], Daniels и соавт. [30], High и соавт. [39], Reid и соавт. [94, 98]).  

Фенотип Leach (Ge:-2,-3,-4) может быть обусловлен разными причина­ми. У 5 не состоящих в родстве лиц, выявлена делеция экзона 3 и 4 гена GYPC (High и соавт. [39], Johnson, Daniels [44], Telen и соавт. [121], Winardi и соавт. [129]). В то же время из ретикулоцитов лиц Ge:-2,-3,-4 были выделены обыч­ные транскрипты гена GYPC (Winardi и соавт. [129]).

У другого индивида Ge:-2,-3,-4 выделен полноценный ген GYPC, одна­ко при секвенировании экзона 3 отмечена мутация, образующая стоп-кодон в позиции 56 (Telen и соавт. [121]). При этом не транслировалась большая часть экзона 3 и весь экзон 4. Тем не менее у обследуемых был выявлен небольшой фрагмент с мол. массой 12 кДа, напоминавший терминальную часть гликофо­ринов С и D (Pinder и соавт. [88]). В связи с этим высказано предположение, что трансляция дефектного гена GYPC может начинаться в других точках.

Имеется несколько сообщений о низкой экспрессии на эритроцитах Ge:-2,-3 антигенов Kell. Степень подавления у индивидов Ge:-2,-3 варьиро­вала (Anstee и соавт. [5], Daniels и соавт. [25, 30], McShane, Chung [67], Nash и соавт. [77], Okubo и соавт. [81]). Снижение экспрессии отмечено в отноше­нии часто встречающихся антигенов Kell, в также антигена KEL1. У одного ин­дивида отмечена слабая экспрессия антигена KEL11 (Daniels [25]), выражен­ность других антигенов соответствовала норме. В 9 из 11 образцов эритроцитов Ge:-2,-3 отмечена слабая выраженность антигенов Kell. В то же время шесть образцов эритроцитов Ge:-2,3 имели нормальную экспрессию этих антигенов.

У 4 лиц Ge:-2,-3,-4 экспрессия антигенов Kell была слабой (Anstee и соавт. [5], Daniels и соавт. [30], McShane, Chung [67]).

Фенотипическая зависимость антигенов Kell от системы Gerbich реализует­ся, по-видимому, не на генетическом уровне, поскольку гены, контролирующие синтез вещества Gerbich и вещества Kell, расположены на разных хромосомах и непосредственное влияние их друг на друга исключено.