Как указывают многие исследователи, вновь создаваемые методы определения антител должны быть по уровню чувствительности не ниже классической непрямой пробы Кумбса с использованием раствора низкой ионной силы (LISS) (Voak [679, 680], Bruce и соавт. [185], BCSH (Британский комитет по стандартизации в гематологии) [557], Poole и соавт. [533]).
Weisbach и соавт. [701] сравнили результаты определения антиэритроцитар-ных антител с помощью микрокапиллярных колонок и непрямой пробы Кумбса и нашли, что чувствительность микрокапиллярного метода в отношении клинически значимых антител несколько выше, чем непрямой реакции Кумбса. Однако авторы не могли выявить анти-Лса-антитела обоими сравниваемыми методами в 4 из 12 случаев.
Уместно подчеркнуть, что определение антител с помощью микрокапиллярных колонок включало инкубацию реагирующей смеси в течение 15 мин, а в непрямой реакции Кумбса инкубация составляла 10 мин, что весьма существенно.
Fitzsimmons и Morel [287] установили, что увеличение времени инкубации реагирующей смеси повышает чувствительность непрямой реакции Кумбса. Дополнительные 5 мин инкубации могут быть решающими в выявлении более слабых антител.
Voak и соавт. [682] также привели данные о том, что продолжительность инкубации важна для выявления некоторых образцов слабых антител анти-1ка, aHTH-Fyb и анти-К при использовании 1,5-2% суспензии эритроцитов в растворе низкой ионной силы.
Bromilow и соавт. [183], Kretschmer и соавт. [399] считают, что тесты на микрокапиллярных колонках Dia Med (Швейцария) чувствительнее, но Voak и соавт. [681], Phillips и соавт. [524], Pinkerton и соавт. [527] отмечают, что этот тест не более чувствителен, чем хорошо выполненная непрямая проба Кумбса с LISS.
На наш взгляд, возможные причины того, что методы, основанные на использовании микрокапиллярных колонок, дают лучшие результаты, чем непрямая проба Кумбса с LISS, могут заключаться, в следующем:
- микрокапиллярные гелевые технологии включают центрифугирование реагирующих ингредиентов непосредственно во время реакции, что существенно усиливает агглютинацию эритроцитов. Центрифугирование при выполнении непрямой пробы Кумбса используют только для отмывания эритроцитов и это никак не сказывается на выраженности агглютинации. В то же время, если использовать центрифугирование на стадии взаимодействия сенсибилизированных эритроцитов с антиглобулиновой сывороткой, то выраженность реакции можно существенно усилить;
- гелевые технологии имеют объективную, независимую от оператора, автоматизированную систему учета результатов, в то время как пробирочные тесты, в том числе непрямая проба Кумбса с LISS, оценивают субъективно, и результат во многом зависит от навыков оператора. Имеются указания на то, что чрезмерное встряхивание реагирующей сме-и может искажать результаты. Исследования, проведенные в рамках совместной программы «Международного комитета стандартов в гематологии» и «Международного общества переливания крови» показали, что чрезмерное встряхивание при ресуспендировании взвеси эритроцитов является причиной ложноотрицательных результатов (Holburn [352], Voak и соавт. [684]).
Причиной искажения результатов может быть также недостаточное отмывание эритроцитов (Voak и соавт. [683]).
В 1981 г. Voak и соавт. [684] провели серию экспериментов для изучения проблем, связанных с отмыванием эритроцитов при постановке непрямой антиглобулиновой реакции. Авторы исследовали эритроциты, сенсибилизированные слабыми aHTH-D-антителами IgG, реагирующими с авидностью от + до ++. Для отмывания эритроцитов применяли разные солевые растворы и различные режимы центрифугирования. Установлено, что даже при использовании хорошо зарекомендовавших себя отмывающих растворов регистрируют ложные результаты.
Применение слепого метода для оценки работы персонала подтвердило, что примерно 20 % кадровых сотрудников ошибались в 5 % случаев при использовании эритроцитов, сенсибилизированных aHTH-D-антителами IgG, которые реагировали, как указывалось выше, с авидностью от + до ++ (Voak и соавт. [683]).
Причиной ошибочных результатов при выполнении непрямой реакции Кумбса может служить примесь антикомплементарных антител в поликлональ-ных тестовых антиглобулиновых сыворотках. Чаще всего встречаются антитела к СЗ-компоненту комплемента. При инкубации свежей сыворотки, смешанной с эритроцитами, на последних может адсорбироваться комплемент, что создает видимость положительного результата.
Проблема специфичности поликлональных антиглобулиновых сывороток была в значительной мере решена, когда Международный комитет стандартов в гематологии [370] утвердил стандартные процедуры, необходимые для контроля примеси анти-СЗё-антител в этих тестовых реагентах.
С целью предупреждения ошибок при учете результатов непрямой реакции Кумбса в программу обучения специалистов службы крови Англии включен слепой тест на выявление слабых антител, позволяющий проводить быстрое обучение и коррекцию любых ошибок, сопровождающих скрининг антител. Этот тест может быть использован для оценки результатов работы каждого работника. С 1987 г. он рекомендован Британским комитетом по Щандартам в гематологии для специалистов-иммуносерологов госпитальных банков крови [325].
В 1993 г. в Англии введен национальный референтный реагент анти-D IgG для контроля методов и мастерства операторов в отношении слабой, выявляемой нередко только под микроскопом агглютинации (Phillips и соавт. [523]).
Важным этапом в стандартизации методов выявления антиэритроцитарных антител и повышения их чувствительности явилось использование автоматических ридеров для плат (Poole и соавт. [533]), а также разработка гелевых методов DiaMed (Швейцария), Auto Bio Vue (Англия), Scan Gel (Франция, США).
Гелевые методы весьма перспективны. По оценкам специалистов, набор оборудования для гелевого метода может заменить 3-4 работников, что в экономически развитых странах покрывает расходы достаточно быстро. Однако использование такого оборудования, стоимостью 150-160 тыс. долларов США, в отечественной службе крови представляется в настоящее время нерентабельным, поскольку в сравнении с отечественными методами определения групповой и резус-принадлежности крови оно на порядок дороже. Кроме того, иммуносеро-логам хорошо известно, что ни одна из автоматизированных систем не может выявить все существующие антитела в их многообразии.
Например, Cummins и соавт. [240] нашли, что гелевые методы DiaMed, Auto Bio Vue в ряде случаев не выявляют слабую несовместимость по системе АВО, которую выявляет простая пробирочная проба. Гелевые тесты в ряде случаев не выявляют слабые антитела aHra-Fya, анти-Лса, анти-S, анти-К (Voak и соавт. [681], Phillips и соавт.
Причиной этого является все то же центрифугирование, которое разрывает слабые агтлютинаты в процессе принудительного продавливания их через плотный гель. При исследовании 100 образцов плазмы группы В(Ш) с эритроцитами A2B(IV) гелевым тестом DiaMed не выявлено 68 случаев несовместимости, тестом Auto Bio Vue - 76 случаев, а 5-минутный пробирочный тест с 0,9% NaCl -8 случаев (Phillips и соавт. [522]).
Важным компонентом при определении антител наряду с методикой являются используемые стандартные эритроциты. Результативность скрининга во многом зависит от качества эритроцитов, присутствия в них тех или иных антигенов.
Какие эритроциты рекомендуется использовать для скрининга антител? В ответе на этот вопрос нет единого мнения. Для повседневного скрининга антител используют одно-, двух- и трехклеточные панели стандартных эритроцитов, содержащие максимальное количество трансфузионно опасных антигенов: D, С, Е, с, е, К, k, Fya, Jka, М, N, S, s, Lea, Lua и др.
Для идентификации антиэритроцитарных антител используют многоклеточные панели, включающие Cw и Кра (Penny) и др., в том числе редкие антигены в гомо-и гетерозиготном варианте. Такие панели требуют лаборатории с большим набором реагентов, хранилищем жидкого азота (Voak и Scott [685]). Некоторые исследователи полагают, что в высокочувствительных методах (СканГель, DiaMed и др.) можно использовать пулированные эритроциты, полученные смешиванием нескольких гомозиготных образцов. Так, Lillevang и соавт. [442] считают, что смесь из двух образцов эритроцитов не менее надежна в серологических реакциях, чем те же образцы Эритроцитов, взятые раздельно. Смесь должна содержать эритроциты двух доноров, каждый из которых гомозиготен по разным трансфузионно опасным антигенам.
Eggington и соавт. [270] считают, что применение пулов эритроцитов снижает чувствительность метода, затрудняет интерпретацию результатов, уменьшает процент выявления антител. К такому же выводу пришли Bombail-Girard и соавт [177], Phillips
Возможность создания принципиально отличающейся системы, не связанной с прямым выявлением агглютинации эритроцитов, обсуждается в работе Narayanan и соавт. [503]. Авторы предложили новый способ учета реакции агглютинации в обычном и ультрафиолетовом свете. Эта система получила положительную оценку Министерства здравоохранения США (Poole и соавт. [533]).
Метод дает возможность объективно оценить результаты непрямой реакции Кумбса, однако ряд технических особенностей не позволяет использовать его в конвейерной работе.
Предложены 6 приемов оценки иммуносерологических методов (Voak [679], Poole и соавт. [533]).
- Тест на чувствительность, при котором применяют заведомо слабые антитела. Применение сильных антител сглаживает картину, так как они имеют высокую авидность, поэтому их легко обнаруживают даже в больших разведениях.
- Тест на юспроизводимость метода с использованием гетерозиготных образцов эритроцитов, сенсибилизированных слабыми референтным aHra-D-антителами IgG.
- Титрование антител, относящихся к разным антигенным системам эритроцитов: анти-К, анти-Руа, анти-Jk3 и др. - для установления уровня чувствительности в отношении антигенов каждой системы.
- Пробный подбор совместимых пар донор - реципиент с применением свежих образцов сыворотки и эритроцитов. Такой подбор позволяет выявить лож-ноположительные результаты, обусловленные комплементом исследуемой сыворотки и антикомплементарными антителами, в основном анти-СЗё, присутствующими в тестовых антиглобулиновых реагентах.
- Сравнительные испытания (не менее 3000 тестов) в разных лечебных учреждениях. Такие испытания хорошо выявляют недостатки и слабости любых тестовых систем, обладающих разной степенью чувствительности к тем или иным антигенам и антителам.
- Тесты с гомо- и гетерозиготной формой различных антигенов для отобра методики, которая будет хорошо работать с гетерозиготными эритроцитами. Например, микроплатовые системы Solid Screen (Biotest) и Capture (Immuno) не требуют использования эритроцитов, гомозиготных по данным антигенам, и лучше выявляют слабые антитела, чем системы микрокапиллярных гелевых колонок или классическая непрямая проба Кумбса (Poole и соавт. [533]).
Однако дальнейшие исследования показали, что примерно 50 % образцов эритроцитов Kk низкоавидны при выявлении антител Келл-Челлано. Это дает основание беспокоиться о качестве скрининга антител, так как невозможно обеспечить гомозиготными по антигену К эритроцитами все панели для скрининга антител из-за относительной редкости гомозигот КК: 2-3 образца на 1 тыс. (Phillips, Voak [521]). щ
В литературе имеются сведения о создании иммуносерологических методов нового поколения, основанных на использовании антигенов эритроцитов, выделенных в чистом виде. Возможно, самая лучшая система, которая будет разработана в ближайшем обозримом будущем, позволит проводить скрининг антител с помощью биологического микрочипа, на который нанесены все известные трансфузионно опасные антигены. Над созданием подобных методов работает несколько групп ученых: одна - под руководством М. Scott в Международной референс-лаборатории групп крови (Бристоль, Англия), другая - под руковод-ством М. Read в Центре крови Нью-Йорка. Не исключено, что уже в ближайшие годы мы можем стать свидетелями новых автоматизированных иммуно-ферментных методов определения клинически наиболее значимых эритроци-тарных антител без использования эритроцитов (Ekins [271], Ekins, Chu [272]). Попытки создания биочипов предпринимаются и в нашей стране.
Проанализированные нами данные литературы убеждают в том, что, несмотря на большой выбор автоматизированных методик, наилучшей до настоящего времени остается непрямая проба Кумбса.
По нашему мнению, упомянутое выше малогабаритное оборудование Н.И. Васильева, специально предназначенное для проведения этой пробы, позволяет обеспечить высокое качество подбора совместимой крови для переливания реципиенту.
