Клонирование Rh-гликопротеинов. Структура генов RH

Moore и Green [481] обнаружили, что в процессе иммунной преципита­ции полипептидов D и сЕ специфическими антителами одновременно с по­липептидами преципитируются N-гликозилированные белки, получившие на­звание RhAG (Rh-ассоциированные гликопротеины), или Rh-гликопротеины. Компоненты этих белков, сопровождающие полипептиды D и еС, имели не­сколько отличающуюся мол. массу, но одинаковую N-концевую аминокислот­ную последовательность [147].

Ridgwell и соавт. [565] клонировали фрагменты кДНК, соответствующие

Rh-связанному гликопротеину, и выделили кДНК полной длины из библио­теки кДНК костного мозга человека. Полученный Rh-гликопротеин содер­жал 409 аминокислот и имел, подобно полипептидам Rh, 12 мембранных до­менов с внутриклеточными N- и С-концевыми участками. Аминокислотная последовательность Rh-гликопротеина и Rh-полипептида различалась. Сходство ограничивалось двумя аминокислотными остатками в первом и пя­том домене: Glu 13 и Glu 146 - в гликопротеине Rh, Glu 21 и Glu 146 - в по­липептиде Rh [565].

Структура генов RH

В 1972 г. Ruddle и соавт. [587] удалось определить, что генный локус систе­мы резус расположен на хромосоме 1. Затем он был картирован на коротком плече хромосомы в участке 1р34.3-р36.13 [211,453,462].

Когда была получена кДНК, соответствующая Rh-полипептидам, ее можно было использовать в качестве зонда в Саузерн-блоте для исследования геном­ной ДНК, т. е. определения структуры генов RH.

Результаты этих исследований подтвердили, что локус RH включает 2 очень похожих гена (СЕ и £>), а один из этих генов отсутствует в гДНК, выделенной у нескольких неродственных лиц D- [233]. Таким образом была установлена мо­лекулярная основа общего для европеоидов фенотипа Rh-, который часто обу­словлен делецией гена D.

Ген D включает 10 экзонов и имеет организацию, похожую на структуру гена СЕ, но не идентичную ей (см. рис. 4.7).

Гены D и СЕ различаются по интрону 4 [138]. В гене СЕ имеется деле­ция 650 пар нуклеотидов, начинающаяся в интроне 4 от нуклеотида 181 [146]. Интрон 4 гена СЕ имеет 1976 пар нуклеотидов. Нуклеотиды в положении 1-181 и 831-1076 примерно идентичны в генах D и СЕ. Интрон 5 генов DnCE вклю­чает 1636 пар нуклеотидов. Имеется 29 нуклеотидных различий между этими двумя генами (98,2 % гомологии).

Организация гена СЕ исследована Cherif-Zahar и соавт. [209]. В связи с тем что антиген D обусловлен геном, отсутствующим у людей Rh-, определение молекулярной структуры антигенов Сс и Ее упростилось.

Mouro и соавт. [496] экстрагировали матричную РНК людей с редким фе­нотипом СсЕе и использовали синтетические олигонуклеотидные праймеры в присутствии обратной транскриптазы для получения кДНК полной длины, со­ответствующей продукту гена СЕ.

Присутствие антигенов Е и е было обусловлено заменой пролина на аланин в позиции 226. Пролин в этой позиции придавал субстрату специфичность Е, аланин - специфичность е (см. рис. 4.5).

При сравнении кДНК лиц, содержащих антигены С и с, ситуация ока-лась сложнее. Наблюдали 6 различий в нуклеотидах, одна часть из кото­рых (Cysffl6, He 60, Ser 68, Sep 103) коррелировала с экспрессией С, другая (Тгр 16, Leu 60, Asn 68, Pro 103) - с экспрессией с (hr¹) [496]. Эта находка была подтверждена амплификацией гДНК от людей с известным фенотипом: экзон 1 и 2 кодировал остатки, специфичные для антигенов Сс, а экзон 5 | специфичные для антигенов Ее.

Cherif-Zahar и соавт. [208] высказали предположение, что, хотя антигены Сс и Ее являются продуктами одного и того же гена и кодированы одним видом мРНК, возможен альтернативный сплайсинг, формирующий несколько белков. Полипептид полной длины кодирует экспрессию антигенов Ее, а не Сс; сплай-сеоформа, в которой отсутствует экзон 5, кодирует экспрессию Сс, но не Ее. Гипотеза подтверждается тем фактом, что из препаратов мРНК людей Rh- мо­гут быть выделены разные продукты гена СЕ.

По мнению Umenishi и соавт. [666], сплайсеоформы не являются произво­дными гена СЕ\ они могут также происходить от гена D. Некоторые сплайсео­формы выделены из незрелых эритробластов.

В экспериментах Smythe и соавт. [618] антигены с и Е были получены de novo на поверхности эритроидных клеток К562, в которые был введен ретро-вирус, комбинированный с кДНК, соответствующей сЕ-экспрессии. Поскольку использованная кДНК была полной длины, это отчетливо подтвердило, что ан­тигены с и Е находятся на одном и том же полипептиде.

Аминокислотная замена, определяющая Е- и е-специфичность [Pro 226 (ан­тиген Е), Ala 226 (антиген е)], находится в четвертой внеклеточной петле по­липептида СЕ. Эта локализация полностью соответствует серологическим раз­личиям антигенов Е и е. Однако антигенные различия обусловлены не толь­ко аминокислотной заменой, но и соответствующим молекулярным окружени­ем. Полипептид D также имеет остаток аланина в положении 226, но не несет е-антигенности.

Структура антигенов С и с сложнее, потому что полипептиды СЕ имеют 4 аминокислоты для антигена С и 4 - для антигена с, одна из которых [Ser 103 (антиген С) или Pro 103 (антиген с)] расположена на второй внеклеточной пет­ле полипептида.

Три из четырех аминокислот (Не 60, Ser 68, Ser 103), которые отличают С-активный полипептид от с-активного, обнаружены также в D-полипептиде. Этщ 3 аминокислоты кодируются экзоном 2 гена СЕ и экзоном 2 гена D. Не исключено, что именно благодаря этому подобию антигенов D и С антитела анти-D могут содержать анти-С-специфичность даже в тех случаях, когда эри­троциты, послужившие антигенным стимулом, не имели серологически выяв­ляемого антигена С, т. е. это был «чистый D». Во многом идентичная топология полипецтидов, кодируемых генами D и СЕ, лежит в основе перекрестных реак­ций антигенов и антител системы резус.

Считается, что гены RH синтезируют полипептиды, несущие Rh-антигены, не используя субстанций-предшественников.

Добавить комментарий