Инструментальные методы выявления антител

История инструментальных автоматизированных методов иммуносерологического исследования начинает свой отсчет с 1960-х годов.

В 1963 г. в США McNeil и соавт. [473] предложили для определения группы крови анализатор «Техникой», применявшийся для биохимических исследова­ний. В основу прибора положен принцип движущихся порций эритроцитов, от­деленных друг от друга воздушной перемычкой, по спирально извитым пласти­ковым трубкам, в которые подают тестовые стандартные сыворотки. Длина тру­бок и скорость проталкивания образцов были рассчитаны таким образом, чтобы тестовые сыворотки успевали прореагировать с антигенами исследуемых эри-троцитов. Результаты учитывали фотометрическим методом: измерением раз­ности светопоглощения реагирующей смеси до и после реакции.

Анализатор McNeil представлял собой одноканальный прибор, что не позво­ляло проводить несколько исследований параллельно.

Для повышения чувствительности анализатора Sturgeon и соавт. [641] предложили предварительную обработку эритроцитов протеолитическими ферментами растительного происхождения. Наиболее эффективным для этих целей оказался бромелин - фермент, выделяемый из млечного сока стеблей ананасов.                                                                                                                                                                                                                                                 

Далее Sturgeon и соавт. [643] применили многоканальные варианты прибо-ра, анализирующие образец крови одновременно по нескольким параметрам, что существенно расширило возможности анализатора и его пропускную спо­собность. Авторы сконструировали 8-канальный прибор, определяющий груп­пу крови АВО и резус.

Затем были сконструированы 10-15-канальные системы (Peoples и соавт. [518], Moore, Fernandes и соавт. [478]), что позволило автоматизировать не только определение антигенов эритроцитов АВО и резус, но и проводить реакции на сифилис (Shoeter и соавт. [610]) и австралийский антиген (Berkman и соавт. [166], Moore, Fernandes [478]).

Широкое применение нашел БМЦ-тест (бромелинметилцеллюлозный), который повысил чувствительность приборов при выявлении антител Rh-Hr, Lewis, Kell, Daffy.

Заметным прогрессом в развитии автоматизированных методов серологи­ческого исследования явилась предложенная Lalezari [407] методика с исполь­зованием полибрена, с помощью которой выявляли антигены и антитела си­стемы Daffy, Kell, Kidd, MNSs в тех случаях, когда ферментная техника оказы­валась неэффективной.

Протеолитические ферменты существенно активируют реакцию связывания ан­тигенов и антител системы резус, однако, по мнению некоторых авторов, разруша­ют антигены Kell, Daffy (Nevaulinna, Pircola [505], A.A. Рагимов, Н.Г. Дашкова [92]).

Habibi и соавт. [332] применили одновременно несколько ферментных те­стов: ПМЦ-тест (папаинметилцеллюлозный), ТМЦ-тест (трипсинметилцел-люлозный) и полибреновый тест, что дало возможность проводить скрининг антител различного характера с максимально широкой специфичностью, улав­ливать те разновидности антител, которые выявляют исключительно каким-либо одним методом.

Более того, была автоматизирована антиглобулиновая проба Кумбса (Valeri и соавт. [675]), что создало предпосылки для внедрения оборудования, предназна­ченного для повседневного автоматизированного скрининга антител различной специфичности (Cotton, Ray [239], Moore [477]), в том числе аутоантител, фик­сированных на эритроцитах (Gorska и соавт. [310]), а также послужило основой автоматизации пробы на индивидуальную совместимость донора и реципиента при переливании эритроцитов (Wattar и соавт. [699]).

Rowe и соавт. [586] предложили полностью автоматизированную многоканальную систему «Техникой М-16» с микропроцессорным оснащением для интерпретации результатов серологических реакций и ввели в систему сканирующее лазерное устройство, идентифицирующее исследуемые образцы крови по бар-коду. Впервые бар-код в анализаторах групп крови был применен во французских приборах «Групаматик».

Одновременно с созданием в США анализаторов групп крови «Техникой» во Франции с 1963 по 1969 год под руководством Matte [465] была разработа­на принципиально отличающаяся автоматизированная система «Групаматик» (Groupamatic-50, -250, -360 соответственно на 50,250,360 определений в 1ч).

В отличие от аппаратов «Техникой» в приборах «Групаматик» был применен ком­пьютер, что обеспечило автоматическую интерпретацию результатов и вывод их на печать. Наиболее производительный вариант прибора представлял собой 12-каналь-ную систему, рассчитанную на исследование 360 образцов крови в 1 ч (Soulier [621]).

Другое немаловажное отличие системы «Групаматик» от системы «Техникой» заключалось в способе учета результатов серологических реакций. Визуальный учет результатов в автомате был заменен оптическим способом ре­гистрации: фотометрией жидкой части смеси и осадка (Unger, Ramgren [672]).

В приборах «Групаматик» для повышения чувствительности реакции было применено центрифугирование реагирующей смеси с последующим ресуспен-дированием посредством встряхивания. Это важная деталь в проведении имму-носерологических реакций.

Весьма существенным также было то, что выдачу ошибочных результатов (не укладывающихся в закономерности групповой дифференцировки крови людей) прибор блокировал.

Последующее техническое усовершенствование автоматов «Групаматик» по­зволило увеличить объем исследований, выполняемых при апробации донор­ской крови, а именно: ввести исследование сыворотки крови доноров на си­филис, гепатит, а также идентифицировать дозы крови при их выдаче потреби­телю, что при обычном, не автоматизированном, выполнении этой процедуры было источником ошибок (Р.А. Авдеева, Л.П. Лаврова [5]).

В аппаратах «Групаматик» успешно применяются те же методы, что и в аппаратах «Техникой»: бромелинметилцеллюлозная техника (Garetta и соавт. [297]), трипсин-полибренцитратная техника (Confida и соавт. [235]), антигаобулиновый метод (Matte [466]), реакция конглютинации в коллоидных средах (Habibi и соавт. [333]). Базовой серологической методикой приборов «Групаматик» является бромелиновая техника, обеспечивающая оптимальное определение наиболее значимых факторов в клиниче­ской трансфузиологии - группы крови АВО и резус-принадлежности (Haahty [330], O.K. Гаврилов и др. [25], Р.А. Авдеева и др. [4,5], Л.П. Лаврова и др. [73,74]).

Приборы «Групаматик» нашли применение в США, Англии, Японии, Швеции, Австрии. По своим техническим характеристикам - пропускной спо­собности, чувствительности реакций, надежности получаемых результатов -они выгодно отличались от других автоматов (Soustelle и соавт. [623]).

Известны модификации приборов для определения групп крови: «мини-Групаматик» (Reviel, Emblin [562]) и варианты прибора «Техникой» (Severns и соавт. [603]), позволяющие выполнять реакцию в микроплатах, что существен­но сокращает расход реагентов (Descamps и соавт. [260]).

Обращает на себя внимание предложенный в 1986 г. метод агглютинации в геле [261], который представляет собой комбинацию двух методов: агглютина­ции и гель-фильтрации*.

Попытки создания автоматических анализаторов групп крови были предпри­няты и в нашей стране. В 1990 г. в Гематологическом научном центре Российский Академии медицинских наук совместно с научно-исследовательским и конструк­торским институтом медицинской лабораторной техники Минмедпрома СССР был разработан и успешно прошел лабораторные испытания первый отечествен­ный анализатор групп крови - АГК-01 (А.Н. Алипов и др. [7], Р.С. Каландаров [63]). Прибор представлял собой полуавтоматическую систему, в которой были автоматизированы отдельные этапы реакции: разведение пробы, перемешивание

Метод подробно описан в книге А.А. Рагимова и Н.Г. Дашковой: «Основы трансфузион-ной иммунологии» [91].

нгредиентов реакции (эритроцитов и сывороток), центрифугирование смеси, учет результатов реакции, вывод результатов на печать. Производительность при­бора - 48 образцов крови в час.

По нашему мнению, реакция агглютинации эритроцитов как специфический фе­номен - быстропротекающий процесс, имеющий сложные био-физико-химические составляющие. Этот взгляд нашел подтверждение в работах Р.С. Каландарова [63], а также других авторов (Wardlaw и соавт. [698], B.C. Андреев [8]).

Поиск новых физических принципов оценки реакции агтлютинации представляет чрезвычайный интерес для теории и практики иммуносерологических исследований.

В последние годы получены интересные данные о своеобразном действии ультразвука на взвесь корпускулярных частиц (Н.Н. Князьков [65]). Ультразвук нарушает суспензионную стабильность эритроцитов и приводит к их быстрому оседанию (СИ. Донсков и др. [43], Р.С. Каландаров и др. [63,64]).

В течение нескольких секунд после подачи ультразвука взвесь эритроцитов расслаивается, образуются видимые агрегаты эритроцитов, которые после от­ключения ультразвука начинают быстро оседать на дно пробирки. Как отмеча­ют Н.Н. Князьков [65] и Р.С. Каландаров [63], ультразвук может найти примене­ние в анализаторах серологических реакций нового поколения.

В последние годы Narayanan и соавт. [503] разработали новую технологию типирования крови, основанную на спектроскопии в видимой и ультрафиолето­вой части спектра. Группу крови определяют по изменению оптической плотно­сти взвеси эритроцитов в присутствии агглютинирующих антител. Оптическая плотность ниже 665 нм соответствует отрицательному результату, выше 1000 нм - положительному. С помощью этого метода удалось с достаточно вы­сокой степенью совпадения определять группу крови и резус-принадлежность.

Несмотря на очевидные успехи в развитии автоматизированных серологических методов исследования, возможности их совершенствования далеко не исчерпаны.

Идеология конструирования анализаторов серологических реакций пер­вого поколения (приборы «Техникой», «Групаматик», «Контифло») бази­ровалась на принципе полной автоматизации без участия оператора, что­бы исключить ошибки, связанные с так называемым человеческим факто­ром. Процесс определения, согласно этой идеологии, должен быть поточным (конвейерным) и по возможности универсальным, пригодным для определе­ния максимального спектра антигенов и антител, отличающихся своими се­рологическими и физико-химическими характеристиками. Такое оборудова­ние предназначалось для крупных банков крови, имеющих огромную произ­водительность. Однако за всем этим не усматривались потребности неболь­ших, но наиболее многочисленных, особенно для Российской Федерации, структуру- отделений и кабинетов переливания крови. Их в Российской Федерации насчитывается более 1000.

Специальное малогабаритное оборудование разработанное Н.И. Васильевым |24}, адаптировано для проведения пробы на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента в условиях отделения переливания крови, в непо­средственной близости от постели больного.

Добавить комментарий