Идентификация резус-принадлежности по ДНК более сложная процедура, чем ДНК-типирование групповых антигенов АВО, Lewis и др. Это можно объяснить тем, что большинство антигенных систем эритроцитов человека кодируется простыми, часто одиночными нуклеотидными заменами, встречающимися с большим постоянством. Различия антигенов Rh обусловлены множественными нуклеотидными заменами и сложными перестройками в генах RHD и RHCE, поэтому, несмотря на высокую степень гомологии этих генов, трудно найти для амплификации соответствующие участки, которые отличались бы друг от друга с достаточным постоянством.
Наиболее контрастные отличительные признаки генов D и СЕ отмечены в 3!-концевом участке экзона 7 [441, 721], интроне 4 [138, 194, 615, 616], экзонах 3-7 и 9 [298,381,420,452].
Определение резус-принадлежности индивида по его ДНК сводится к установлению последовательности аминокислот в указанных выше участках генов RH с помощью ПЦР. Сравнивая результаты ПЦР, полученные с испытуемым образцом ДНК и контрольными образцами, можно сделать заключение о том,
какому типу (D+ или 0§§ соответствует аминокислотная последовательность исследуемого субстрата.
Генотип, определяемый по ДНК, не всегда совпадает с серологически выявляемым фенотипом. Так, Du или парциальный D-антиген, диагностированный с помощью ПЦР, может не соответствовать результатам серологических исследований, в которых они проявляют себя как обычный D. Нередко ПЦР выявляет фрагменты гена D у лиц D-, на основании чего делают вывод, что данные лица генетически являются резус-положительными, но имеют неэкспрессирующий ген Д вследствие чего серологически их идентифицируют как резус-отрицательные.
Avent и соавт. [146], Rouillac и соавт. [582] указывают, что более точные результаты удается получить с помощью двух ПЦР, направленных к разным участкам гена. Еще более точные результаты получили Gassener и соавт. [298], Legler и соавт. [420], Maaskant-van Wijk и соавт. [452] при использовании комплексной ПЦР, фокусированной на несколько экзонов, например: 3-7,9.
Bennet и соавт. [162] выявили с помощью соответствующих олигонуклеотид-ных праймеров продукт из 186 пн от З'-концевого некодирующего участка экзона 10 гена Д в то время как ген СЕ не давал продукта от этого участка экзона 10.
Volter и соавт. [721] предложили метод, основанный на установлении различий, имеющихся в экзоне 7 генов D и СЕ. Авторы сравнили продукт из 155 пн гена D и 146 пн гена СЕ. Применяя этот метод с соответствующими контролями, можно определить, является ли человек гетеро- или гомозиготным по гену D.
Метод, предложенный Simsek и соавт. [615], включает амплификацию нитрона 4 генов D и СЕ. Продукт ПЦР, полученный от гена СЕ9 составляет 1200 пн, а продукт гена D - 600 пн, так как интрон 4 гена D имеет делецию 650 пн.
Когда эти различные методы были опробованы на большом числе образцов ДНК, полученных от людей с известным фенотипом D, стало очевидно, что не все люди D- имеют делецию гена D.
Simsek и соавт. [615] выявили 3 человека с фенотипом Cde, которые типирова-ны как D+, и 2 человека с фенотипом CcDe, типированных как D-. Авторы идентифицировали ген D по экзону 10, что дало несовпадающие результаты. Многие исследователи признают, что такие расхождения при использовании ПЦР встречаются, и что типирование антигена D по ДНК должно производиться как минимум двумя различными тестами и по разным районам гена D [146,441,616].
Hyland и соавт. [368] сообщили о 2 донорах с фенотипом Cde, один из которых имел фрагменты гена Д присутствующие выше 5!-участка экзона 1 и внутри З'-некодирующего участка. Последовательности гена Д обычно расположенные между экзонами 7 и 10, у этого донора отсутствовали. У другого донора был нормальный ген D в обследованных участках.
Blunt и соавт. [174], Carritt и соавт. [194] обнаружили у 8 неродственных доноров негров с фенотипом Cdes делецию гена Д однако экзоны 8-10 присутствовали. В методе идентификации гена D с помощью ПЦР по экзону 10 такие индивидь! типируются как D+.
Carritt и соавт. [194] обратили внимание на высокую частоту лиц монголоидной расы, которые имели нормальный ген D, но настолько слабый антиген D, что его можно было выявить только с помощью адсорбции - элюцииЛ
Qun и соавт. [541] исследовали ДНК 74 резус-отрицательных китайцев народности хан. У 46 из них специфические для гена D экзоны отсутствовали. У 22 обнаружена мутация G 1227 А, характерная для фенотипа Del. У 5 человек имелся гибридный ген RHD(l-2)-CE(3-9)-D(10). Один исследованный имел эк-зон 6 гена RHD с необычной мутацией С 93 А. Авторы выделяют 3 возможные, по их мнению, механизма, приводящие к формированию резус-отрицательного фенотипа: делеция гена RHD, гибридный ген RHD-CE-D и мутация С 93 А. Причем 2 последних механизма вносят определенные разногласия в результаты гено- и фенотипирования. При генотипировании обследуемый человек идентифицируется как D+, а при фенотипировании - как D-.
Аллель-специфическая ПЦР разработана для генотипирования антигенов hr' (с) и rh" (Е) [417], rh" (Е) и hr" (е) [280], D, С и с [536], а также для установления гомо- и гетерозиготности индивида по генам RH [519].
Определенные успехи достигнуты в идентификации антигена D на ранних стадиях развития эмбриона по ДНК, экстрагированной из амниоцитов, присутствующих в амниотической жидкости.
Следует отметить, что из-за сложности ДНК-типирования антигена D методы молекулярной диагностики, включая полимеразную цепную реакцию, редко применяют взамен серологического типирования. Исключение составляют случаи судебно-медицинских экспертиз, имеющих целью установить или исключить родственные отношения между обследуемыми. В этих случаях ДНК-типирование, в том числе по системе резус, практически не дает сбоев.
С целью проверки достоверности результатов определения групповой принадлежности крови молекулярно-биологическими методами проведено I Международное рабочее совещание по генотипированию групп крови в рамках Международного общества трансфузиологов и Международного комитета по стандартизации в гематологии.
ЦРабота сводилась к следующему: в 30 профильных лабораторий направлены контрольные образцы ДНК взрослых людей и новорожденных с закодированным фенотипом. Как следует из отчетного доклада, представленного Daniels и соавт. [249], после сравнения полученных результатов выяснилось, что ошибки идентификации молекулярными методами составили от 0 до 11 %. С тем, чтобы предупредить возможные ошибки, рабочее совещание решено проводить раз в два года.